揭秘苯硝唑：小鼠慢性恰加斯病模型中 PK/PD 关系与抗寄生虫活性研究

恰加斯病（Chagas disease）治疗面临困境，一线药物苯硝唑（benznidazole）存在局限。本文通过生物发光成像（BLI）技术研究苯硝唑在小鼠体内的药代动力学 / 药效学（PK/PD）关系，为优化其给药方案提供关键依据，助力恰加斯病治疗研究。

　　

引言

恰加斯病（CD）是由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi，T. cruzi）引起的热带寄生虫病，在 21 个拉丁美洲国家流行，全球约 600 - 700 万人感染，7500 万人面临感染风险。随着人口迁移和全球化，其传播范围扩大，成为全球公共卫生问题。

CD 分为急性期和慢性期。急性期多无症状或症状轻微，慢性期多数患者无症状，但 20% - 30% 会发展为心脏疾病，少数出现胃肠道疾病。目前仅有硝呋莫司和苯硝唑两种药物治疗 CD，但它们存在严重局限性，如在慢性期治愈率不稳定、耐受性差，导致治疗中断率高。因此，急需新的治疗方案。

药物研发面临诸多困难，如对疾病病理和宿主 - 寄生虫相互作用了解有限，临床试验结果不理想等。目前优化苯硝唑治疗方案成为研究热点，包括探索更短疗程、更低剂量、间歇给药或联合疗法。然而，由于缺乏预测寄生虫学治愈和临床疗效的生物标志物，确定最佳治疗方案面临挑战，苯硝唑剂量、血浆暴露和治疗反应之间的关系也尚不明确。

生物发光成像（BLI）技术的发展为研究 CD 提供了新途径，可实时监测小鼠体内寄生虫负荷，有助于评估苯硝唑治疗效果，本研究旨在利用该技术建立苯硝唑在小鼠 CD 模型中的 PK/PD 关系。

方法

感染实验经 LSHTM 伦理委员会批准，在英国内政部许可下进行；苯硝唑疗效研究操作遵循许可要求；非感染小鼠的药代动力学（PK）研究符合澳大利亚动物实验规范，经莫纳什药学院动物伦理委员会批准。

采用高灵敏度 BLI 方法评估苯硝唑对慢性感染T. cruzi的 BALB/c 小鼠的疗效。7 - 8 周龄雌性 BALB/c 小鼠感染 1000 个生物发光的T. cruzi CL Brener 血锥鞭毛体，在感染慢性期经口灌胃给予苯硝唑。慢性感染定义为急性期后的稳定阶段，通常在感染后 50 - 70 天过渡，此后感染稳定。小鼠自由进食和饮水，苯硝唑剂量根据体重调整，范围为 10 - 100 mg/kg，给药 5 - 20 天。通过体内和体外成像评估疗效，免疫抑制后成像阴性视为治愈。

血浆浓度 - 时间数据来自先前发表的非感染小鼠卫星 PK 研究（n = 52）。雌性 BALB/c 小鼠经口灌胃给予单剂量 10 mg/kg（n = 16）、30 mg/kg（n = 18）或 100 mg/kg（n = 18）苯硝唑，固定剂量体积为 0.2 mL / 小鼠。在不同时间点采集血样，离心分离血浆，储存于 - 80°C，采用 UPLC - MS/MS 分析，定量下限为 5 ng/mL。

对卫星 PK 研究中未感染 BALB/c 小鼠的 PK 数据进行分析。共收集 110 个给药后 PK 样本，排除 2 个异常值，对部分数据进行 censoring 处理，最终 90 个高于定量下限的样本纳入分析。使用非线性混合效应模型（NONMEM v7.4）分析血浆浓度 - 时间数据，采用多种工具辅助分析，通过比较目标函数值（OFV）选择模型。探索不同房室模型和吸收模型，评估协变量对 PK 参数的影响，进行模型诊断和验证。

利用最终的非感染卫星小鼠 PK 模型模拟苯硝唑疗效研究中不同给药方案的血浆浓度 - 时间曲线，提取如峰值血浆浓度（C_MAX）、不同时间点曲线下面积（AUC₁₂、AUC₂₄、AUC_∞）和高于目标浓度的时间（T>IC₉₀）等参数。目标浓度 IC₉₀基于体外实验确定，并校正了蛋白结合。

采用二元单变量逻辑回归模型评估模拟药物暴露与治愈（体内和体外成像均为 BLI 阴性）之间的关系，研究不同暴露变量（如 C_MAX、AUC₁₂、AUC₂₄、AUC_∞和 T>IC₉₀）对寄生虫学治愈的预测作用。通过多种指标评估模型拟合优度和预测性能，包括 Akaike 信息准则（AIC）、贝叶斯信息准则（BIC）、McFadden 伪 R²和受试者工作特征曲线下面积（ROC）等。同时使用偏最小二乘判别分析（PLS - DA）进一步探索 PK/PD 指数参数组合对寄生虫学治愈的预测作用。

结果

共 118 只小鼠接受 10 种给药方案治疗，数据包含文献数据和新实验结果。高剂量（100 mg/kg）、短疗程（5 天或 10 天）或中等剂量（50 mg/kg）、多次给药（每天 2 次，10 天）方案治愈率较高；低剂量（10 - 30 mg/kg）、短疗程方案治愈率低。

利用 52 只非感染雌性 BALB/c 小鼠的 PK 数据，最终确定苯硝唑的 PK 特征符合单房室处置模型，一级吸收和消除。高剂量给药时吸收速率显著减慢，虽然高剂量有降低清除率的趋势，但因数据不确定性未纳入最终模型。最终模型参数估计精度良好，能较好描述浓度 - 时间曲线，预测性能佳。不同剂量组的 C_MAX、AUC_∞等参数不同，且总暴露量近似呈剂量线性。

模拟不同给药方案的血浆浓度 - 时间曲线，发现累积剂量越高，总血浆暴露（AUC_∞）越高，T>IC₉₀越长。PK/PD 指数参数间存在强相关性，分为两组：一组包括单次给药剂量、日剂量、C_MAX、AUC₁₂和 AUC₂₄；另一组包括累积剂量、AUC_∞和 T>IC₉₀。

单变量逻辑回归显示，所有 PK/PD 指数参数与寄生虫学治愈几率显著相关。AUC_∞在二元回归中的解释力稍强，但各参数间差异较小。ROC 曲线显示，C_MAX、AUC_∞和 T>IC₉₀的曲线下面积均超 85%，模型敏感性高但特异性低。优化分类阈值后，基于 AUC_∞或 T>IC₉₀的模型分类准确率达 90%。敏感性分析表明，T>IC₉₀对 IC₉₀变化敏感，且与 AUC_∞相关性强。

PLS - DA 模型确定 AUC_∞、T>IC₉₀和 C_MAX为重要预测因子，但多变量模型与单变量模型（AUC_∞或 T>IC₉₀）的分类性能无显著差异。

讨论

目前苯硝唑的给药方案缺乏充分数据支持，其合理性备受争议。本研究全面分析了苯硝唑在慢性感染T. cruzi小鼠中的剂量、血浆暴露和抗寄生虫活性关系，首次综合考虑多种 PK/PD 指数参数预测寄生虫学治愈，为优化给药方案提供重要依据。

苯硝唑在非感染小鼠中的血浆浓度 - 时间曲线符合单房室模型，与先前研究一致。其吸收动力学呈剂量依赖性，高剂量吸收延迟，C_MAX增加幅度小于剂量比例，而总暴露量近似剂量线性，消除半衰期约 1.3 h。研究存在局限性，如仅使用单剂量数据，无法探究时间依赖性药代动力学，且依赖健康卫星小鼠 PK 数据，不能完全捕捉感染小鼠个体间和个体内的变异性。

在 PK/PD 关系方面，BLI 技术为测量 PK/PD 模型的药效学终点提供了有效手段。AUC_∞、T>IC₉₀和 C_MAX与寄生虫学治愈概率密切相关，但高共线性使确定关键疗效驱动因素困难。IC₉₀的选择对 T>IC₉₀影响大，且苯硝唑作为前药，其血浆水平不能完全反映寄生虫内活性代谢产物的作用。

与现有研究相比，由于动物模型和实验条件的差异，结果存在不一致性。但众多研究都强调了苯硝唑剂量和治疗持续时间对治愈的重要性。目前，增加剂量和延长疗程（间歇给药）与降低标准剂量以提高耐受性这两种策略均在临床评估中，其长期疗效有待验证。本研究表明建立苯硝唑 PK/PD 关系复杂，需进一步开展剂量分割研究，以明确疗效预测因子间的相互作用。

结论

本研究成功量化了苯硝唑在慢性感染T. cruzi小鼠中的剂量 - 暴露 - 反应关系，首次利用临床前 BLI 成像数据研究其 PK/PD 关系，为临床研究提供了有价值的见解。但由于 PK/PD 指数参数共线性高，区分疗效驱动因素困难，建议开展剂量分割研究，以深入了解影响苯硝唑疗效的因素。