一锅法多酶级联反应同步合成与纯化UDP-α-D-葡萄糖醛酸和UDP-α-D-木糖的创新策略

本研究针对糖基转移酶(GT)研究中稀有核苷酸糖底物UDP-α-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-α-D-木糖(UDP-Xyl)获取困难的问题，开发了一种创新的一锅法多酶级联合成体系。通过耦合拟南芥葡糖醛酸激酶(AtGlcAK)、大肠杆菌USP(EcGalU)和人类UDP-木糖合成酶(HsUXS)的协同作用，实现了从廉价底物葡萄糖醛酸(GlcA)出发，经三步酶促反应高效合成两种核苷酸糖，并通过阴离子交换色谱同步纯化，最终获得83%收率的UDP-GlcA和65%收率的UDP-Xyl。该研究为糖基化研究提供了重要的底物制备方法，解决了糖生物学研究中的关键试剂瓶颈问题。

　　

在糖生物学研究领域，糖基转移酶(Glycosyltransferases, GT)作为催化糖苷键形成的关键酶类，其功能研究一直受限于稀有核苷酸糖底物的获取难题。特别是UDP-α-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-α-D-木糖(UDP-Xyl)这两种重要底物，前者是药物代谢中葡萄糖醛酸化的关键供体，后者参与蛋白聚糖生物合成等生理过程。传统化学合成法步骤繁琐，而现有酶法合成又面临NAD⁺辅因子成本高、多步纯化效率低等瓶颈。如何建立高效、经济的制备方法，成为推动糖基化研究的关键突破口。

针对这一挑战，法国奥尔良大学分子化学研究所的研究团队在《Carbohydrate Research》发表创新成果，巧妙设计了一锅法多酶级联反应体系。该研究整合了拟南芥葡糖醛酸激酶(AtGlcAK)的1-磷酸化能力、大肠杆菌UDP-糖焦磷酸化酶(EcGalU)的UDP转移活性，以及人类UDP-木糖合成酶(HsUXS)的脱羧功能，实现了从廉价GlcA出发的连续转化。通过优化反应条件和建立同步纯化策略，最终获得高纯度产物，为糖基化研究提供了可靠的底物来源。

关键技术方法包括：1) 构建重组表达系统获得AtGlcAK、EcGalU和HsUXS三种核心酶；2) 建立含ATP再生系统(丙酮酸激酶PK/磷酸烯醇丙酮酸PEP)的一锅法反应体系；3) 采用离子对HPLC实时监测反应进程；4) 开发基于DEAE阴离子交换色谱的两步纯化方案，结合碱性磷酸酶处理去除杂质。

2.1. 从GlcA酶法合成UDP-GlcA(反应A)
研究首先优化了两步酶促反应：AtGlcAK催化GlcA生成GlcA-1-磷酸，EcGalU随后将UTP的UMP基团转移到磷酸糖上。通过引入EcPPase降解副产物焦磷酸推动平衡，反应24小时后UDP-GlcA转化率达97%，经DEAE纯化后获得192mg产物(收率83%)。值得注意的是，这是首次报道EcGalU用于UDP-GlcA合成，拓展了该酶在核苷酸糖制备中的应用范围。

2.2. 从UDP-GlcA酶法合成UDP-Xyl(反应B)
利用重组HsUXS催化UDP-GlcA脱羧，72小时后转化率达到50%。不同于前人使用辅因子再生系统强行推动完全转化，本研究有意保持部分转化以实现双产物同步获取。通过75mM与250mM NH₄HCO₃梯度洗脱，成功分离两种核苷酸糖，最终获得28mg UDP-Xyl(收率64.9%)。

2.3. 一锅法连续合成与同步纯化
将反应A与B直接串联，省去中间纯化步骤。意外发现串联反应的UDP-Xyl转化效率提升至60%，优于单独反应B。20mL规模实验最终获得59mg UDP-GlcA(27%收率)和125.4mg UDP-Xyl(65%收率)，总分离收率达92%。核磁共振(1H NMR, 13C NMR)和高分辨质谱(HRMS)证实产物结构与标准品一致。

该研究通过精巧的酶组合设计，建立了首个能同步生产两种稀有核苷酸糖的一锅法体系。相比传统分步合成，该方法减少了纯化步骤，提高了整体效率，且避免了昂贵辅因子的使用。特别值得注意的是，反应条件的优化使EcGalU成功应用于UDP-GlcA合成，HsUXS在无辅因子再生系统下仍保持较高活性，这些发现为其他核苷酸糖的制备提供了新思路。未来通过整合更经济的磷酸供体再生系统，如多聚磷酸激酶等，可进一步降低生产成本。这项成果不仅解决了糖基化研究的底物瓶颈问题，其模块化设计思路更为复杂糖链的酶法合成提供了重要参考。