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三阴性乳腺癌（TNBC）预后差且缺乏有效治疗。研究人员围绕 Rasal2 与外泌体（Exos）分泌关系展开研究，发现 Rasal2 KO 通过抑制 Rab27a 活性促进自噬性 Exos 分泌，Rab27a KD 可逆转该效应，为 TNBC 诊疗提供新方向。
乳腺癌作为全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其亚型三阴性乳腺癌（TNBC）因缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体 2（HER2）表达，具有更高的异质性和侵袭性，预后极差，目前临床仍缺乏有效的靶向治疗手段。肿瘤微环境中，肿瘤细胞分泌的外泌体（Exos）作为直径约 30-150 nm 的细胞外囊泡，携带多种生物分子，在肿瘤进展中扮演关键角色。前期研究发现，Rasal2（Ras 蛋白激活剂样 2）对乳腺癌的调控作用依赖外泌体介导，但其与外泌体分泌的具体机制尚不明确。在此背景下，青岛大学基础医学院的研究人员开展了相关研究，旨在揭示 Rasal2 调控 TNBC 进展的分子机制，为临床诊疗提供新靶点。该研究成果发表在《Journal of Translational Medicine》。
研究人员主要采用以下关键技术方法：利用 CRISPR/Cas9 技术构建 Rasal2 敲除（KO）的 MDA-MB-231 细胞系，并通过 siRNA 转染建立 Rab27a 敲低（KD）的 KO+KD 细胞模型；运用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫印迹分析（WB）鉴定外泌体；通过共聚焦显微镜观察自噬流及自噬体与多泡体（MVBs）的共定位；借助免疫共沉淀分析验证 Rasal2 与 Rab27a 的相互作用；利用免疫组织化学分析检测荷瘤小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白表达。
外泌体的分离与鉴定
通过差速超速离心从 MDA-MB-231 细胞培养上清中分离纯化细胞外囊泡，经 NTA 和 TEM 分析显示，其粒径分布在 50-200 nm，呈圆形或椭圆形，表面电位与细胞膜一致，且表达 CD9、CD63 等外泌体标志物，证实为外泌体。
Rasal2 缺失促进 TNBC 自噬性外泌体分泌
构建 Rasal2 KO 细胞系后发现，其外泌体分泌量显著增加，且外泌体中自噬标志物 LC3 和 P62 表达升高。通过 GFP-LC3 稳定过表达细胞模型进一步证实，Rasal2 KO 细胞来源的外泌体中绿色荧光强度增强，提示自噬相关蛋白积累与自噬过程相关。
Rasal2 缺失干扰自噬通路
TEM 和荧光显微镜观察显示，Rasal2 KO 细胞中自噬体数量增多。Western blot 分析表明，LC3 和 P62 表达升高，且经自噬抑制剂 BafA1 处理后进一步增强，提示自噬体降解受阻。利用 mCherry-EGFP-LC3 双荧光质粒检测发现，Rasal2 KO 细胞中自噬溶酶体比例降低，溶酶体酸度减弱，表明 Rasal2 缺失通过降低溶酶体酸度阻断自噬流。
Rasal2 缺失诱导分泌自噬
TEM 观察发现，Rasal2 KO 细胞中多泡体（MVBs）及其内含囊泡（ILVs）数量和体积增加，共聚焦显微镜显示自噬体与 MVBs 共定位增强，且经 BafA1 处理后进一步促进融合。NTA 和 WB 分析表明，抑制溶酶体功能可显著增加外泌体分泌及自噬相关蛋白表达，证实 Rasal2 KO 诱导分泌自噬，即自噬体因降解受阻与 MVBs 融合形成自噬性外泌体并分泌至细胞外。
Rab27a 介导 Rasal2 KO 诱导的自噬性外泌体分泌
免疫共沉淀证实 Rasal2 与 Rab27a 存在相互作用，GTP 珠下拉实验显示 Rasal2 抑制 Rab27a 活性。构建 KO+KD 细胞系后发现，Rab27a KD 显著减少外泌体分泌及自噬相关蛋白表达，恢复 Rab27a 表达则逆转该效应。此外，Rab27a KD 可增加溶酶体酸度，恢复自噬流，表明 Rab27a 介导 Rasal2 KO 诱导的分泌自噬和自噬性外泌体分泌。
抑制分泌自噬促进 TNBC 进展
体外实验显示，Rasal2 在 TNBC 细胞中高表达，Rasal2 KO 抑制细胞增殖、迁移和侵袭，而 Rab27a KD 可逆转该抑制效应。体内荷瘤小鼠模型表明，Rasal2 KO 显著抑制肿瘤生长，Rab27a KD 则恢复肿瘤生长速度，免疫组织化学和血清外泌体分析显示相关蛋白表达变化与体外结果一致，证实 Rab27a 通过调控分泌自噬影响 TNBC 进展。
本研究揭示了 Rasal2 通过抑制 Rab27a 活性阻断自噬流，诱导分泌自噬并促进自噬性外泌体分泌，进而调控 TNBC 进展的分子机制。研究首次明确 Rab27a 在 Rasal2 介导的肿瘤微环境调控中的关键作用，为 TNBC 的早期诊断（如血浆自噬性外泌体作为生物标志物）、靶向治疗（干预 Rab27a 或自噬通路）及预后判断提供了新的理论依据和潜在策略，有望推动 TNBC 精准医学的发展。
