新型PEI-醛共轭物增强基因递送效率并促进人间充质干细胞软骨分化的研究

这篇研究通过修饰聚乙烯亚胺(PEI)构建了兼具阳离子(胍基)和疏水(醛基)功能的新型基因载体PEIT2T3A。该载体显著提高了对人间充质干细胞(hMSCs)的转染效率(提升12.2倍)，同时降低细胞毒性，并成功通过递送SOX9质粒(psox9)促进软骨分化，表现为COLII和聚集蛋白聚糖(ACAN)表达上调及蛋白聚糖沉积增加。研究为基于hMSCs的软骨再生治疗提供了安全高效的非病毒载体方案。

　　

引言
基因治疗和再生医学为疾病治疗带来新机遇，但安全高效的基因递送系统仍是关键挑战。聚乙烯亚胺(PEI)作为经典非病毒载体，虽具有DNA缩合能力和"质子海绵效应"，但其高细胞毒性和在hMSCs中低于10%的转染效率限制了应用。研究通过化学修饰PEI，引入胍基醛(3-胍-N-(3-氧丙基)丙酰胺[T1]和1-(4-甲酰苯基)胍[T2])与疏水醛(辛醛[T3A]和十二醛[T3B])，构建了新型PEI-醛共轭物，旨在提升基因递送效率并促进hMSCs软骨分化。

材料与方法
通过核磁共振(H NMR)和质谱(ESI-MS)验证了T1/T2合成。采用荧光胺法测定PEI游离氨基，以70/30、87.5/12.5和93/7的阳离子/疏水醛比例制备PEI衍生物。通过动态光散射(DLS)测定粒径(PEIT2T3A为364.84±3.32 nm)和zeta电位。使用SYBR Green排除实验和DNase保护实验评估DNA结合能力。选用hMSCs(CD90⁺>96%)和iMSCs模型，通过β-Glo和流式细胞术检测placZ/pGFP转染效率，WST-8法测定细胞活性。采用抑制剂(氯丙嗪/染料木素)和共聚焦显微镜分析内吞途径。通过三维聚集体培养评估psox9转染后的软骨分化，采用实时定量PCR、组织化学(甲苯胺蓝)和免疫组化(COLII/SOX9)进行表征。

结果
物化表征显示PEIT2T3A/placZ复合物粒径显著小于PEI(348.33 vs 421.18 nm)，且在N/P=7时转染效率最高。在hMSCs中，PEIT2T3A使β-半乳糖苷酶活性提升8.2倍，GFP表达增加26倍，同时维持85%细胞活性。机制研究表明其主要通过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞(染料木素抑制后转染下降4.6倍)。在软骨诱导实验中，PEIT2T3A/psox9使SOX9表达上调5.9倍，COLII和ACAN表达分别增加5.2倍，蛋白聚糖含量提升2.2倍，且显著抑制COLI表达(52.95 vs 78.99像素强度)。

讨论
PEIT2T3A的优异性能源于其平衡的电荷/疏水性：胍基增强DNA结合(模仿精氨酸富集肽)，辛醛链促进膜融合和内体逃逸。相比传统PEI，该修饰使转染效率提升12倍的关键在于：1)缩小的粒径(364.84 nm)利于细胞摄取；2)降低表面电荷减少细胞损伤；3)优化内吞途径。在软骨分化方面，持续表达的SOX9有效激活软骨特异性基因网络，且未引发明显肥大化(COLX无显著变化)。

结论
该研究开发的PEIT2T3A载体突破了hMSCs难转染的瓶颈，其70/30的阳离子/疏水比例和N/P=7的配方在基因递送效率与生物相容性间取得最佳平衡。通过递送psox9成功引导hMSCs向软骨谱系分化，为关节软骨修复的细胞治疗提供了新型工具。未来可进一步探索其在体内软骨再生模型中的应用及与其他生长因子(TGF-β3)的协同效应。