基于轻敲模式扫描探针电喷雾电离的单细胞脂质质谱成像技术揭示HeLa细胞亚细胞异质性

本研究针对细胞异质性分析的技术瓶颈，开发了轻敲模式扫描探针电喷雾电离(t-SPESI)单细胞质谱成像(SC-MSI)系统，实现了HeLa细胞亚微米级脂质分布的多模态成像（荧光/离子/形貌），鉴定出PC 34:1[M+H]+等29种差异脂质分子，为疾病机制研究提供了单细胞分辨率的新型分子成像工具。

　　

在生命科学领域，细胞异质性如同神秘的拼图，始终困扰着研究人员。传统质谱技术虽能解析整体样本的分子组成，却难以捕捉单个细胞间的微妙差异。特别是脂质分子——这些构成细胞膜的主要成分，其亚细胞分布与肿瘤发生、神经退行性疾病等过程密切相关。然而现有成像技术面临两难困境：二次离子质谱(SIMS)虽能达到纳米级分辨率但易导致分子碎片化，基质辅助激光解吸电离(MALDI)需要复杂的前处理且空间分辨率有限。如何实现单细胞水平完整脂质分子的高精度成像，成为亟待突破的技术瓶颈。

日本大阪大学等机构的研究团队在《Communications Chemistry》发表创新成果，通过开发轻敲模式扫描探针电喷雾电离(t-SPESI)系统，成功实现了HeLa细胞单细胞质谱成像(SC-MSI)。这项研究巧妙融合了三种关键技术：1）集成倒置荧光显微镜的t-SPESI单元，实现2μm像素的多模态同步成像；2）氨基修饰硅胶颗粒填充的微流控探针，形成直径4μm的稳定液桥；3）优化的L型离子传输管（内径1.25mm），将离子传输效率提升至传统设计的2.8倍。研究选用表达线粒体靶向荧光蛋白的HeLa mCAT细胞和过表达葡萄糖神经酰胺合酶的HeLa IP-cGCS细胞作为模型，通过超临界流体色谱串联质谱(SFC-MS/MS)验证成像结果。

【高精度多模态成像系统开发】
研究人员设计的t-SPESI单元通过激光位移传感器实时监测探针振幅（656-657Hz），结合PID反馈控制使振幅波动小于1%。该系统在玻璃基底上形成的液桥平均直径仅4.0±0.87μm，单次提取消耗溶剂25fL。倒置显微镜观察证实，探针扫描时溶剂不会在细胞表面扩散，确保亚细胞级空间分辨率。

【微液桥稳定的探针设计】
突破性地采用氨基修饰硅胶颗粒(3μm)填充毛细管探针，解决了传统十八烷基硅胶颗粒在高电压下迁移的问题。氢键作用使颗粒在6.7μm/s扫描速度下保持稳定，配合纳流泵(1nL/min)实现持续溶剂供给。该设计使探针尖端孔径缩小至2μm，较前期研究提升一个数量级。

【离子传输管优化】
对比两种离子传输管发现，1.25mm内径的S型管在300℃时NaI簇离子信号强度达到峰值，较2.18mm的L型管提高36%。理论计算表明，缩小流道截面积可增强离子汇聚效应，同时加热促进带电液滴去溶剂化。

【HeLa细胞多模态成像】
对固定后的HeLa细胞进行SC-MSI分析，发现PC 34:1[M+H]⁺在细胞核区域信号降低40%，而在核侧区（高尔基体定位处）升高2.3倍。形貌图像显示细胞高度500nm-1μm，振幅图像反映出细胞边缘的反馈控制延迟效应。这种多参数关联成像首次在单细胞水平揭示细胞形态与脂质分布的对应关系。

【细胞类型区分与脂质定位】
通过Welch t检验从166种脂质中筛选出29种差异分子（p<0.005）。mCAT细胞的SM d18:1/22:0[M+H]⁺信号强度是cGCS细胞的3.1倍，而cGCS细胞的HexCer d18:1/22:0[M+H]⁺高出2.8倍。值得注意的是，鞘磷脂(SM)呈现全细胞分布模式，与PC的细胞器特异性分布形成鲜明对比，这与其作为细胞膜信号分子的生物学功能相符。

这项研究开创性地将扫描探针技术与质谱成像相结合，突破了传统方法在单细胞分析中的限制。t-SPESI技术无需复杂样本前处理，即可实现亚细胞级脂质可视化，为肿瘤异质性、药物代谢等研究提供了新