SUMO 结合凹槽突变体互作网络揭示 SUMO 结合的替代模式及对 SUMO 化修饰的深远影响

本文聚焦 SUMO 非共价互作机制，利用 SUMO2/3 的 SIM 结合凹槽突变体和质谱技术，鉴定出 WD40 重复结构域蛋白等 SIM 非依赖型互作蛋白，解析了 SEC13 与 SUMO 的作用位点，还发现突变体影响 SUMO E3 连接酶结合及靶蛋白共价修饰，为 SUMO 互作组研究提供新资源。

　　

研究背景与目的

蛋白质的小泛素样修饰物（SUMO）化修饰在转录、基因组稳定性和细胞周期进程等多种细胞过程中至关重要。SUMO 化包括共价修饰和非共价相互作用，其中经典的 I 类 SUMO-SIM（SUMO 相互作用基序）相互作用是研究最深入的非共价作用模式，但其他类型的 SUMO 相互作用仍知之甚少。本研究旨在通过 SUMO2/3 的 SIM 结合凹槽突变体，特异性筛选不通过该凹槽结合的 SUMO 互作蛋白，揭示 SUMO 互作组的复杂性及对 SUMO 化修饰的影响。

研究方法

1. 突变体制备与互作筛选：构建 SUMO2/3 的 SIM 结合凹槽突变体（如 I33A-K34A-R35A（SUMO2 IKR）、Q30A-F31A-I33A（SUMO2 QFI）等），将 His¹⁰标记的野生型（WT）和突变型 SUMO 偶联至 Ni-NTA 磁珠，与 HeLa 细胞全裂解液孵育，通过质谱分析鉴定非共价互作蛋白。
2. 数据验证与分析：利用免疫印迹验证部分互作蛋白（如 RNF4、SEC13、SEH1L 等）的结合情况，通过 STRING 分析、MCODE 聚类和基因本体（GO）富集分析对互作蛋白进行功能和结构域分析。
3. 结构建模与突变分析：使用 AlphaFold-3 对 SEC13 与 SUMO2 的相互作用进行建模，预测关键作用位点，并通过体外突变实验验证 SEC13 的 WD40 结构域和 SUMO2 C 末端残基在互作中的作用。
4. SUMO 化修饰分析：构建表达 His¹⁰-SUMO2/3 WT 或突变体的 HeLa 细胞系，通过 Ni-NTA 下拉富集 SUMO 化蛋白并进行质谱分析，探讨非共价互作对共价 SUMO 化的影响。

研究结果

1. SUMO 互作蛋白的鉴定与分类：通过质谱分析，在 SUMO2 和 SUMO3 的 WT 及突变体中分别鉴定到 1434 和 1321 个蛋白组。根据与 WT 和突变体的结合情况，将互作蛋白分为仅结合 WT（依赖 SIM 结合凹槽）和同时结合 WT 与突变体（SIM 非依赖）两类。其中，仅结合 WT 的蛋白富集于 RNA 代谢、DNA 修复和 SUMO 化调控等过程，而 SIM 非依赖的蛋白则与蛋白折叠、细胞周期和 DNA 复制相关。
2. WD40 重复结构域蛋白的 SIM 非依赖型结合：结构域富集分析发现，WD40 重复结构域在 SIM 非依赖的互作蛋白中显著富集。免疫印迹和 GST 下拉实验证实，SEC13 和 SEH1L 等 WD40 结构域蛋白可直接与 SUMO2/3 结合，且不依赖 SIM 结合凹槽。AlphaFold-3 建模及突变实验表明，SEC13 的 WD40 结构域中的 P59、Y79、I151、R216、Q236 等残基与 SUMO2 C 末端的 D84-G92 区域（尤其是 F86-Q87-Q88-Q89-T90）相互作用。
3. SUMO 化修饰依赖于非共价互作：与表达 SUMO2 WT 的细胞相比，表达 SIM 结合凹槽突变体（如 IKR）的细胞中 SUMO 化蛋白显著减少，尤其是依赖 SUMO E3 连接酶（如 PIAS 家族、RANBP2、ZNF451、TOPORS 等）的底物。这些 E3 连接酶仅与 SUMO2/3 WT 结合，提示其功能依赖于 SIM 结合凹槽介导的非共价互作。而 UBC9、SAE1/UBA2 等 SUMO 化 machinery 组分则可同时与 WT 和突变体结合，表明其作用可能不依赖于该凹槽。

讨论

本研究通过 SIM 结合凹槽突变体筛选，揭示了 SUMO 互作的多样性，证实 SIM 非依赖的互作模式（如 WD40 结构域介导的结合）普遍存在，且其重要性被低估。WD40 结构域作为一种广泛存在的蛋白互作支架，可能通过其 β- 螺旋顶部的特定环区与 SUMO 的 C 末端结合，为 SUMO 互作机制提供了新视角。此外，SUMO E3 连接酶对 SIM 结合凹槽的依赖表明，非共价互作在共价 SUMO 化过程中起关键作用，可能通过招募 UBC9 或促进 SUMO 从 UBC9 的释放来实现。本研究为深入理解 SUMO 互作组的复杂性及 SUMO 化调控机制提供了独特资源，也为相关疾病（如癌症、基因组不稳定相关疾病）的治疗靶点开发提供了新思路。