真核生物 N6- 甲基腺嘌呤（6mA）从头甲基转移酶的鉴定与表征

N6- 甲基腺嘌呤（6mA）作为真核生物中重要的表观遗传修饰，其从头甲基转移酶（MTase）一直未明确。本研究利用嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）有性生殖过程，鉴定出 AMT2 和 AMT5 为 6mA 从头 MTase，揭示其建立 - 维持通路及生物学意义，为表观遗传研究提供新视角。

　　

研究背景：探索真核生物 6mA 甲基化的 “未知谜题”

在生命的遗传与调控网络中，表观遗传修饰如同隐藏的 “暗线”，调控着基因的表达与功能。N⁶- 甲基腺嘌呤（6mA）作为真核生物中备受关注的表观遗传标记，其在转录、复制、DNA 损伤响应等多种分子通路中扮演关键角色，甚至与应激反应、胚胎发育及肿瘤生长等生理病理过程密切相关。然而，尽管已知 6mA 可通过半保留方式在 DNA 复制中维持，但其在未甲基化 DNA 上的从头甲基化过程由何种酶催化，一直是领域内的 “未解之谜”。

经典的 5 - 甲基胞嘧啶（5mC）甲基化路径分为从头甲基化和维持甲基化两步，分别由 DNMT3A/3B 和 DNMT1 催化。类比之下，6mA 是否遵循类似的双阶段路径？其从头甲基转移酶又是否存在？解开这些问题，不仅能完善 6mA 的生物学机制，更可能为表观遗传调控网络的理解提供关键拼图。带着这些疑问，研究人员将目光聚焦于单细胞真核生物嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）—— 其独特的有性生殖过程中，含 6mA 的大核（MAC）降解，而不含 6mA 的小核（MIC）发育成新的大核，必然涉及从头甲基化过程，为研究提供了天然的 “实验窗口”。

研究主体：中国研究团队的关键发现

中国研究团队针对嗜热四膜虫展开研究，聚焦 MT-A70 家族蛋白。通过基因敲除、免疫荧光（IF）、质谱（MS）、单分子实时循环一致性测序（SMRT CCS）等技术，系统分析了 AMT2 和 AMT5 在 6mA 甲基化中的作用。研究发现，这两种蛋白是催化 6mA 从头甲基化的关键酶，其缺失会导致子代大核中 6mA 水平显著下降，影响基因表达模式及有性后代存活率。该成果发表于《SCIENCE ADVANCES》，为真核生物 6mA 的表观遗传机制研究带来突破性进展。

主要技术方法

1. 基因编辑与敲除：构建 AMT2、AMT5 单敲除及双敲除（ΔAMT2/5）细胞株，结合有性生殖过程分析 6mA 动态。

2. 表观遗传检测技术：
   

• 免疫荧光（IF）：定位 6mA 及 AMT 蛋白在细胞核中的分布。

• 质谱分析（MS）：定量检测 6mA 水平变化。

• 单分子实时测序（SMRT CCS）：高分辨率分析 6mA 甲基化位点及模式。

3. 细胞生物学与功能验证：观察敲除细胞的有性生殖进程、后代存活率及基因表达谱变化。

研究结果

1. AMT2 和 AMT5 不参与 6mA 维持，特异性作用于从头甲基化

在营养生长阶段，AMT2/5 敲除细胞的大核 6mA 水平与野生型（WT）无显著差异，且 AMT2/5 蛋白未在体细胞大核中表达，表明其不参与 6mA 维持。而在有性生殖阶段，AMT2/5 在新大核发育时期高表达，定位于新形成的大核中，提示其与从头甲基化相关。

2. AMT2 和 AMT5 是从头甲基化必需酶

在完全敲除 AMT2/5 的细胞中，新大核的 6mA 信号几乎完全消失，质谱及 SMRT CCS 显示 6mA 水平骤降至野生型的约 15%。通过回补实验证实，仅野生型 AMT2/5 能恢复 6mA 信号，而催化结构域突变的 AMT2（如 APPA、APPF）无法恢复，表明其催化活性不可或缺。

3. 6mA 缺失影响有性生殖进程及后代存活

敲除细胞的有性生殖进程延迟，尤其在混合后 10-14 小时更为明显，且后代存活率显著低于野生型。转录组分析显示，敲除细胞的基因表达模式与野生型差异显著，进一步证实 6mA 从头甲基化对细胞功能的重要性。

4. AMT1 在缺乏 AMT2/5 时表现有限的从头甲基化活性

尽管 AMT1 主要负责维持甲基化，但其在 AMT2/5 缺失时可对少量 ApT 位点进行从头甲基化，生成半甲基化及全甲基化位点。然而，其效率仅为野生型的 10%-20%，且依赖 AMT1 蛋白水平上调，提示 AMT2/5 是从头甲基化的核心酶，AMT1 仅起辅助作用。

5. 6mA 甲基化模式在新大核与体细胞大核中的异同

SMRT CCS 显示，新大核与体细胞大核的 6mA 均主要分布于 ApT 二核苷酸，富集于基因体 5' 端，但新大核的全甲基化比例较低，部分高甲基化位点未被维持，提示从头甲基化与维持甲基化在机制上存在差异。

研究结论与讨论：解析 6mA 的 “双阶段密码”

本研究首次明确了真核生物中 6mA 的从头甲基转移酶 ——MT-A70 家族的 AMT2 和 AMT5，揭示其与维持甲基转移酶 AMT1 共同构成的 “从头 - 维持” 双阶段甲基化路径。AMT2/5 通过催化未甲基化腺嘌呤生成半甲基化 6mA，继而由 AMT1 转化为全甲基化，确保 6mA 在世代间的稳定传递。这一机制与哺乳动物中 5mC 的 DNMT3A/3B-DNMT1 路径形成显著类比，表明表观遗传甲基化的双阶段模式可能是真核生物的保守特征。

研究还发现，AMT2/5 的功能具有协同性，且依赖保守的催化结构域（如 AMT2 的 DPPW 基序），而 AMT5 可能通过异源二聚化增强 AMT2 的活性。此外，6mA 在嗜热四膜虫中的分布与转录活性相关，提示其通过表观遗传调控单细胞生物的基因表达网络，这与哺乳动物中 5mC 侧重基因沉默的功能形成对比，反映了表观修饰在不同生物中的进化多样性。

该研究不仅填补了 6mA 机制研究的关键空白，也为理解真核生物表观遗传调控的统一性与特异性提供了新模型。未来，进一步探索 AMT2/5 与其他表观因子（如组蛋白修饰 H3K4me3、H2A.Z）的互作，以及其在其他真核生物中的同源蛋白功能，将为揭示 6mA 的广泛生物学意义奠定基础。