基于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）降解角质酶的祖先序列重建揭示复杂且未探索的序列 - 适应性景观

为解决塑料回收难题，研究人员开展 PET 降解酶研究。利用多重祖先序列重建（mASR）探索 PET 降解角质酶进化序列空间，发现多种活性变体，且局部祖先序列嵌入（LASE）可映射适应性景观，为酶工程提供新策略。

　　

塑料污染已成为全球生态治理的重大挑战，每年超 3.5 亿吨塑料被生产，而回收率不足 10%。传统机械回收技术受限，酶法降解作为新型回收手段备受关注，尤其是聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的酶解研究。PET 广泛用于包装和纺织领域，但其稳定结构难以自然降解，开发高效 PET 降解酶成为突破循环经济瓶颈的关键。然而，传统蛋白质工程方法常局限于现有序列空间，难以全面探索酶的优化潜力，亟需新策略挖掘功能性变体并解析其进化机制。

为此，研究人员开展了针对 PET 降解角质酶的进化序列空间探索研究。通过多重祖先序列重建（multiplexed ancestral sequence reconstruction, mASR）技术，结合系统发育分析，深入挖掘细菌角质酶家族中 PET 降解活性的进化路径。该研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》，为 PET 降解酶的开发提供了新的理论基础和技术路径。

研究主要采用以下关键技术方法：首先，利用 397 条现存角质酶序列构建 20 个统计等价的系统发育树，通过 mASR 生成约 1600 条祖先序列，从中筛选 48 条进行功能验证；其次，运用紫外吸收法检测 PET 水解产物（对苯二甲酸 TPA、单羟基乙酯 MHET、双羟基乙酯 BHET）以评估酶活性；此外，结合局部祖先序列嵌入（local ancestral sequence embedding, LASE）和图信号处理技术，分析序列 - 适应性景观的拓扑结构；最后，通过晶体学和定点突变技术解析酶结构与功能的关系。

mASR 揭示多样的 PETase 活性祖先

通过 mASR 在不同系统发育背景下重建祖先序列，发现 48 个祖先角质酶中多个变体展现出与现存高效酶（如 LCC、BhrPETase）相当的活性，如 55_547（A_{260 nm}=0.59±0.09）和 35_442（A_{260 nm}=0.37±0.06）。同一系统发育节点的不同重建结果显示活性差异显著，例如 10_543 无活性而 55_547 有活性，表明系统发育树拓扑差异可导致功能推断的显著不同，强调 mASR 在采样多样进化背景中的重要性。

结构分析表明活性进化依赖非活性位点突变

对比活性与非活性祖先的结构发现，PETase 活性的获得并非依赖活性位点的直接改造，而是通过远距位点的中性突变实现。例如，55_547 与无活性的 10_543 仅 9 个位点差异，且多位于远离催化中心的区域。晶体结构显示，活性祖先形成结构域交换二聚体，C 末端柔性区域的二硫键工程（如 N206C/S253C 突变）可使活性提升 2 倍，表明通过稳定结构而非直接修饰活性位点可优化酶功能。

序列重组与适应性景观分析

对祖先序列的模糊重建位点进行单突变和组合突变分析，发现多个重组变体活性超过现存工程酶 LCC^ICCG。例如，35_442 背景下的 E28Q/S196A 组合使活性达 1.42±0.29，显示正上位效应的重要性。通过 LASE 和 one-hot encoding（OHE）两种序列嵌入方式对比发现，LASE 能更有效捕捉与活性相关的序列特征，其构建的适应性景观显示高活性变体多位于高 ruggedness 区域，表明功能优化依赖复杂突变组合，难以通过单步突变实现。

研究结论与意义

本研究通过 mASR 系统性探索了 PET 降解角质酶的进化序列空间，证明祖先序列重建可有效挖掘功能性变体，且 PETase 活性的进化存在多条路径，依赖远距位点突变和结构稳定性调控。LASE 技术为解析蛋白质适应性景观提供了新工具，揭示了序列 - 功能关系的非线性特征。这些发现不仅拓展了对酶进化机制的理解，也为工业酶工程提供了新思路：结合 mASR 和 LASE 可更全面地导航复杂序列空间，加速高效 PET 降解酶的开发，推动塑料循环经济的技术革新。研究结果为解决全球塑料污染问题提供了关键科学依据和技术路径，具有重要的环境和产业应用价值。