钙信号调控费氏弧菌早期生物膜形成与解离的分子机制研究

这篇研究通过时间延迟显微技术揭示了费氏弧菌（Vibrio fischeri）生物膜形成与解离的动态过程，发现钙离子（Ca2+）通过二鸟苷酸环化酶（DGC）CasA调控环二鸟苷酸（c-di-GMP）水平，驱动早期生物膜形成，而解离过程独立于已知多糖（SYP/纤维素）和粘附蛋白（LapV）。研究开发了新型成像分析方法，为微生物共生与致病机制提供了关键工具。

　　

野生型费氏弧菌分离株呈现多样化的聚集与解离表型

研究通过改良Bridges和Bassler的静态时间延迟显微技术，分析了7株不同来源的费氏弧菌（包括鱿鱼共生株ES114和鱼类分离株）在含10 mM CaCl₂的tTBS培养基中的生物膜动态。ES114在4-5小时发生快速协同解离（<10分钟），而ES213和KB2B1形成更大聚集体且解离延迟至6-8小时，MB14A5和SR5甚至在10小时内未完全解离。这种表型多样性表明不同菌株对环境信号的响应机制存在显著差异。

早期聚集与粘附不依赖SYP、纤维素或LapV

通过构建ΔsypQ（SYP缺陷）、ΔbcsA（纤维素缺陷）、ΔlapV（粘附蛋白缺陷）单突变及三突变株，发现这些已知生物膜组分在早期粘附中并非必需。ImageJ宏分析显示，三突变株仅比野生型提前5-20分钟解离，暗示其他表面成分（如鞭毛或脂多糖）可能介导初始粘附。

生物膜解离基本独立于LapG蛋白酶

尽管LapG介导的LapV切割在费氏弧菌解离中已被报道，但ΔlapG突变体仍能完成主要解离事件，仅残留少量生物膜片段。这一现象提示存在未知解离途径，可能涉及其他c-di-GMP调控机制。

协同解离不依赖群体感应信号

通过构建luxI/ainS/luxS三突变株（缺失所有已知自诱导物），发现其解离时序与野生型无显著差异，排除了酰基高丝氨酸内酯（AHL）类信号分子的核心作用，但其他分泌分子可能参与调控。

钙离子浓度与暴露时间调控生物膜动态

在无钙条件下，ES114无法形成稳定生物膜。增加钙浓度（10→40 mM）或延长暴露时间（1小时预孵育）会延迟解离并改变生物膜形态：20 mM以上钙浓度导致更致密的圆形结构，类似典型"蘑菇型"生物膜。通过添加钙螯合剂EGTA可诱导提前解离，且不影响细菌活力，证实游离钙浓度是解离关键信号。

CasA介导的钙感知驱动生物膜形成

ΔcasA突变体丧失粘附能力，而casA过表达株（PnrdR-RBS-casA）形成持续不散的大型生物膜。催化活性位点突变体（G410A）仅形成微小聚集体，证实CasA通过其GGDEF结构域合成c-di-GMP是生物膜形成的必要条件。值得注意的是，casA过表达株对钙敏感性增强，提示c-di-GMP降解机制（如磷酸二酯酶PDE）可能参与解离时序调控。

讨论与展望

该研究建立了费氏弧菌生物膜动态研究的新范式，揭示钙-CasA-c-di-GMP轴是早期生物膜形成的核心通路，而解离机制可能涉及多组分冗余系统。未来需探究鞭毛、菌毛等替代粘附因子，以及VpsR转录因子在casA下游的未知靶基因。这些发现为理解微生物从共生到致病的状态转换提供了分子框架。