靶向扩增子深度测序技术在食源性寄生虫环孢子虫基因分型中的应用评估与特异性分析

这篇来自CDC的研究通过评估2019-2023年临床粪便样本的保存条件、诊断方法对环孢子虫（Cyclospora）基因分型成功率的影响，揭示了固定剂保存样本（如ProtoFix）相较于非营养性运输介质（如Cary-Blair）更利于DNA稳定性，显微镜诊断样本比BioFire GI panel或PCR更易获得≥5个分型标记（成功率83% vs 70%）。研究证实该工作流程对人间环孢子虫具有100%分析特异性（非人类环孢子虫仅1/8标记阳性），为食源性疾病暴发调查提供了分子溯源优化方案。

　　

ABSTRACT
流行病学调查中，环孢子虫（Cyclospora）基因分型是暴发溯源的关键工具。美国CDC自2018年起采用八重靶向扩增子深度测序（Illumina MiSeq）结合CYCLONE聚类算法对临床粪便样本进行分型，但约20%样本因DNA质量不足无法满足≥5个标记的最低要求。本研究系统评估了样本保存条件、诊断方法对分型成功率的影响，并首次验证了工作流程的分析特异性。

INTRODUCTION
环孢子虫病是美国法定报告传染病，主要通过被粪便污染的农产品传播。CDC寄生虫病部门（DPDM）开发的基因分型系统包含2个线粒体和6个核标记，通过CYCLONE算法将样本归类至时空-遗传簇。尽管该技术对暴发簇的识别灵敏度>95%，但样本间DNA质量差异显著影响分型成功率。

MATERIALS AND METHODS
研究纳入2019-2023年接收的粪便样本，记录保存介质（固定剂/非营养介质/无介质）、诊断方法（显微镜/BioFire/PCR）和采集至提取间隔天数。所有样本经UNEX法提取DNA后，采用18S rRNA实时PCR（Ct<38阈值）预筛，成功者进行八重PCR扩增和Illumina测序。特异性评估涵盖39份非环孢子虫寄生虫样本，包括灵长类环孢子虫（C. papionis等）和艾美球虫（Eimeria）。

RESULTS
基因分型成功样本的18S PCR平均Ct值显著低于失败样本（25.8 vs 32.2）。关键发现包括：

1. 保存条件：固定剂保存样本随时间降解最慢（如ProtoFix），非营养介质样本在18天后成功率急剧下降；
2. 诊断方法：显微镜诊断样本成功率最高（83%），显著高于BioFire（71%）和普通PCR（70%）；
3. 特异性：非人类环孢子虫仅在MSR标记检出单倍型，艾美球虫有2份检出变异区段，但均未达≥5标记阈值，分析特异性达100%。值得注意的是，8份人源等孢球虫（Cystoisospora belli）均出现18S PCR假阳性（Ct 30.1-38.1）。

DISCUSSION
固定剂通过抑制细菌生长和维持卵囊完整性提升DNA得率，但传统固定剂（如福尔马林）可能抑制PCR，推荐环保型替代品。显微镜诊断样本的高成功率反映其检测限较高，可能遗漏低载量感染。线粒体MSR标记在近缘物种中的保守性提示其在环境样本筛查中的潜在应用价值，但需结合核标记排除假阳性。该研究为优化食源性疾病分子监测网络提供了实证依据，未来可探索多重商业化分型试剂盒（如CycloTrak）的兼容性。