犬猫狂犬病病毒中和抗体阻断 ELISA 检测方法的建立与验证

本研究建立犬猫狂犬病病毒中和抗体（RVNA）阻断 ELISA 检测方法，以 HEK293T 细胞表达的纯化狂犬病毒糖蛋白（G）为包被抗原，标记抗 G 中和单克隆抗体为阻断抗体。该方法与 FAVN 总符合率 97.43%，具高敏感性、特异性及重复性，为疫苗免疫评估提供可靠工具。

　　

研究背景与目的

狂犬病是由狂犬病毒（RABV）引起的致命人畜共患病，犬类传播导致全球超 99% 人类病例。世界动物卫生组织（WOAH）和世界卫生组织（WHO）推荐中和抗体滴度≥0.5 IU/mL 为有效保护阈值。传统病毒中和试验（VNT）如荧光抗体病毒中和试验（FAVN）虽为金标准，但操作复杂、耗时，不适用于大规模监测。酶联免疫吸附试验（ELISA）因高通量优势被推荐用于群体免疫监测，但现有 ELISA 方法无法特异性检测中和抗体，与 VNT 符合率低。本研究旨在开发一种高特异性、高敏感性的阻断 ELISA 方法，用于犬猫狂犬病中和抗体的准确检测。

材料与方法

1. 关键材料制备：采用慢病毒载体在 HEK293T 细胞中表达纯化狂犬病毒糖蛋白（RABV-G，CTN-1V5G 株），浓度为 0.064 mg/mL；制备人源化单克隆抗体（mAb）25-6C，经 HRP 标记后作为阻断抗体，该抗体对 8 株 RABV 具广谱中和活性。
2. 血清样本：收集中国各地 1356 份犬猫血清，其中 FAVN 检测 < 0.5 IU/mL 样本 298 份，≥0.5 IU/mL 样本 1058 份，用于方法优化与验证。
3. 方法建立：通过间接 ELISA 确定 mAb 25-6C 的 EC₅₀为 51.78 ng/mL；利用棋盘滴定法优化包被抗原（0.25 μg/mL RABV-G）和标记抗体（1:800 稀释 HRP-25-6C）浓度；通过受试者工作特征曲线（ROC）分析确定截断值为 PI≥67.23%，对应敏感性 97.52%、特异性 100%。
4. 性能评估：分析敏感性达 1:16 稀释（0.3125 IU/mL），特异性验证显示与犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）血清无交叉反应；批内变异系数（CV）0.24%-2.25%，批间 CV 1.24%-5.22%，具良好重复性与再现性。

结果与验证

1. 临床样本验证：对 1166 份犬猫血清（犬 658 份、猫 508 份）检测，与 FAVN 总符合率 97.43%，犬血清敏感性 96.9%、特异性 94.37%，猫血清敏感性 99.05%、特异性 97.7%。Spearman 相关分析显示中和抗体滴度与 PI 值呈正相关（r=0.6023）。
2. 不同疫苗株检测效能：对 13 种商业疫苗、10 种毒株免疫血清检测，除 G52、SAD、Pasteur RIV 株外，其余毒株符合率均达 100%，表明方法具广泛适用性。
3. 与商业试剂盒对比：与 3 种市售 ELISA 试剂盒相比，本方法总符合率 99%，显著高于试剂盒 A（89%）、B（88%）、C（73%），且与 FAVN 的 Kappa 值最高（0.979）。
4. 实验室间验证：5 家专业实验室对 50 份盲样检测，符合率 94%-100%，特异性 95%-100%，敏感性 96.67%-100%，显示方法具良好跨实验室重复性。

讨论与结论

现有 ELISA 因特异性不足无法替代 VNT，而本研究通过高纯度 RABV-G 抗原与广谱中和 mAb 的结合，显著提升了检测准确性，尤其在 0.07-0.49 IU/mL 低滴度区间具更高特异性（犬 95%、猫 100%），解决了传统 ELISA 的关键瓶颈。该方法操作简便、成本低，适用于大规模疫苗免疫效果评估，为全球狂犬病防控提供了高效工具。未来需进一步通过国际实验室验证，推动其成为替代 VNT 的标准方法。