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本综述聚焦猪肠道病原菌检测难题，开发三重实时荧光定量 PCR（qPCR）方法，可同时检测胞内劳森菌（LI）、猪痢疾短螺旋体（Bhy）和产气荚膜梭菌（Cp）。对 5702 份样本检测显示三者阳性率分别为 9.54%、2.42%、20.78%，且存在混合感染，该方法为猪群细菌性腹泻快速诊断和监测提供新工具。
研究背景与目的
胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis, LI）、猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae, Bhy）和产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, Cp）是全球猪群常见肠道病原菌，可引发血便、急性死亡、坏死性肠炎等，导致养猪业巨大经济损失。三者常混合感染且症状相似，传统细菌分离培养法耗时、灵敏度低，难以满足快速诊断需求。因此，本研究旨在开发一种能同时快速检测这三种病原菌的三重实时荧光定量 PCR（qPCR）方法，为猪群细菌性腹泻的监测和防控提供科学依据。
材料与方法
引物与探针设计
针对 LI 的aspA基因、Bhy 的16S rRNA基因和 Cp 的α-toxin基因保守区域，利用 SnapGene 和 Primer Premier 5 软件设计特异性引物和探针。LI 探针标记 FAM 荧光基团和 BHQ1 淬灭基团，Bhy 探针标记 Cy5 和 BHQ2，Cp 探针标记 VIC 和 BHQ1。
反应体系与条件优化
在 20 μL 反应体系中，通过梯度试验优化引物（0.20-0.55 μM）和探针（0.25-0.50 μM）浓度，以及退火温度（55-62°C）。确定最佳反应条件为：引物浓度 0.25 μM，探针浓度 0.50 μM，退火温度 60°C。
标准曲线构建
合成 LI（588 bp）、Bhy（600 bp）、Cp（560 bp）目的片段并克隆至 pUC57 载体，制备标准质粒。经 10 倍梯度稀释（10?至 10?1 copies/μL）后进行 qPCR，绘制标准曲线。结果显示，三者 Ct 值与拷贝数呈良好线性关系（R2>0.99），反应效率分别为 96.02%、91.50%、95.22%。
特异性、灵敏度与稳定性验证
特异性试验显示，除三种目标病原体外，大肠杆菌、沙门氏菌、猪流行性腹泻病毒（PEDV）等其他病原均无扩增曲线。灵敏度试验表明，LI、Bhy、Cp 的最低检测限分别为 2.82、14.1、5.63 copies/μL。稳定性试验中，组内和组间变异系数（CV）均低于 1.94%，表明方法稳定性良好。
与传统方法比较
对 40 份临床样本（粪便拭子、回肠、环境拭子）分别采用三重 qPCR（tr-PCR）、常规 PCR（C-PCR）和已报道 PCR（R-PCR）检测。结果显示，tr-PCR 对 LI、Bhy、Cp 的检出率分别为 57.50%、20.00%、32.50%，与 C-PCR 相近，略高于 R-PCR，表明其准确性和可靠性。
临床样本检测
2021-2024 年，对中国猪场和屠宰场的 5702 份样本（粪便拭子、环境拭子、回肠）进行检测。结果显示，LI、Bhy、Cp 的总体阳性率分别为 9.54%（544/5702）、2.42%（138/5702）、20.78%（1185/5702）。其中，LI 和 Bhy 在粪便拭子中阳性率最高（54.23%、68.84%），Cp 在环境拭子中阳性率最高（48.52%）。混合感染率较低，LI+Bhy 为 0.23%，LI+Cp 为 2.35%，Bhy+Cp 为 0.35%，三者混合感染为 0.19%。
讨论与结论
本研究建立的三重 qPCR 方法可在同一反应体系中同时检测 LI、Bhy、Cp，具有快速、特异、灵敏、稳定等优点，与传统方法相比节省 2/3 的时间和成本。临床样本检测表明，三种病原菌在中国猪场中普遍存在，且环境传播不容忽视。尽管混合感染率较低，但其对猪群健康的潜在威胁较大，需加强监测。该方法为猪群细菌性腹泻的早期预警、快速诊断和防控提供了有效工具，有助于猪场制定针对性的防治策略，降低经济损失。
