荷斯坦奶牛口腔拭子微生物群落与产奶指标的关联研究：一种新型瘤胃微生物组替代采样方法的验证与应用

本研究创新性地采用非侵入性口腔拭子采样技术，对226头荷斯坦奶牛的微生物群落与产奶指标（日均产奶量、泌乳天数DIM、总饲料效率GFE和剩余采食量RFI）进行关联分析。结果表明，口腔拭子可捕获70%的瘤胃微生物群落，并成功鉴定出与泌乳阶段显著相关的细菌属（如Alysiella、Moraxella等，P<0.05）。通过差异丰度分析（DESeq2）发现，Prevotellaceae、Acidaminococcaceae等瘤胃特征菌群的ASVs（扩增子序列变异体）与产奶效率显著相关（P<0.05）。研究为大规模牧场管理中瘤胃微生物组监测提供了高效替代方案，为通过微生物调控提升奶牛生产性能奠定基础。

　　

ABSTRACT
荷斯坦奶牛口腔拭子微生物群落研究揭示了其作为瘤胃直接采样替代方法的潜力。通过对美国威斯康星州226头奶牛的采样分析，发现口腔拭子可捕获70%的瘤胃微生物群落。研究将微生物数据与平均产奶量、泌乳天数（DIM）等表型关联，并在部分动物中进一步分析总饲料效率（GFE）和剩余采食量（RFI）。结果显示，口腔拭子能鉴定出与DIM显著相关的细菌属（如Lactobacillus、Prevotella，P<0.05），且瘤胃微生物群落与初产奶牛的产奶量和DIM存在关联。差异丰度分析发现多个与GFE和RFI相关的ASVs（P<0.05），证实了口腔拭子作为瘤胃替代采样的实用性。

IMPORTANCE
提升产奶效率是乳业核心目标，传统方法依赖遗传选择、日粮优化和牧场管理。瘤胃微生物组作为饲料消化的关键因素，其调控可改善效率，但大规模采样难题阻碍了应用。本研究证明口腔拭子是一种可扩展的高效方法，能复现传统瘤胃采样获得的微生物-生产性能关联。

INTRODUCTION
瘤胃微生物群落负责将不可消化饲料转化为营养物质，直接影响奶牛产奶效率（MPE）。MPE可通过GFE和RFI等指标量化。尽管瘤胃微生物数据有助于早期代谢紊乱检测和甲烷减排，但传统采样方法（如胃管插管、瘤胃穿刺）难以大规模应用。粪便样本无法准确反映瘤胃微生物组成，而口腔拭子通过捕获反刍 regurgitation 内容物，提供了一种非侵入性解决方案。前期研究表明，口腔拭子可捕获70%的瘤胃细菌群落，本研究进一步验证其在大规模群体中关联生产指标的可行性。

RESULTS
测序与数据清洗
226头奶牛样本测序获得7,081,688条原始reads，经质控保留5,913,320条。18个低深度样本（<7,000条）被剔除。

细菌群落结构与生产指标关联
α多样性分析显示泌乳阶段间无显著差异（P>0.05）。PCA结合PERMANOVA表明产奶量分组间β多样性无显著差异，但线性建模发现初产奶牛PC2轴与DIM和产奶量显著相关（P<0.05）。Spearman相关性分析鉴定出Alysiella、Moraxella等5个与DIM显著相关的菌属（P<0.05）。DESeq2分析发现61个ASVs与DIM相关，其中Prevotellaceae、Acidaminococcaceae等瘤胃菌群占主导。

产奶效率与微生物群落关联
二产奶牛中，高效GFE组Shannon多样性显著高于低效组（P=0.046）。RFI与PCA的X轴位置显著相关（P<0.05），DESeq2鉴定出130个ASVs在高GFE组富集（如Prevotella、Fibrobacter），101个ASVs在低RFI组富集。三产奶牛中，19个ASVs与高GFE相关，但未发现显著β多样性差异。

DISCUSSION
研究复现了传统瘤胃采样发现的微生物-生产性能关联，如Prevotella与产奶效率的正相关。口腔拭子特有的优势包括：

1. 捕获瘤胃和口腔菌群，可能增强预测模型（如Marcos等发现口腔生物膜形成菌可预测采食量）；
2. 操作便捷性支持牧场级应用，如青年牛生产潜力评估；
3. 为基因组关联研究提供新维度。

MATERIALS AND METHODS
样本采集于威斯康星州Arlington研究牧场，使用Puritan PurFlock拭子刮取口腔颊部。DNA提取后对16S rRNA基因V4区测序（Illumina MiSeq），DADA2处理数据，Silva数据库注释。统计采用Spearman相关、PERMANOVA和DESeq2差异分析。效率数据来自USDA国家数据库回归模型。

研究局限性包括短读长测序对低丰度菌检测的敏感性不足，以及口腔菌群的潜在干扰。未来可通过纳米孔长读长测序或精准控制反刍采样时间优化方法。该技术为牧场微生物组管理提供了前所未有的规模化工具。