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针对腹泻性大肠杆菌（DEC）检测耗时长、灵敏度不足等问题，研究人员开发 TaqMan 单重实时荧光定量 PCR（qPCR）方法，可同时检测 5 种 DEC（EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC）。结果显示该方法检测限低至1.60×101 copies/μL，与传统 PCR 相比准确性更高，为临床和食品安全检测提供高效工具。
论文解读
在全球范围内，腹泻性大肠杆菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）作为重要的食源性病原菌，可通过污染食品引发宿主腹泻症状，其包含的 5 种致病型（EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC）因毒力因子、致病机制和流行病学特征各异，给快速精准检测带来挑战。传统检测方法如细菌培养结合生化鉴定需耗时数天，且灵敏度低，尤其在样本中细菌浓度较低时易漏检，难以满足临床及时诊断和疫情防控需求。因此，开发一种高效、特异的 DEC 检测技术成为保障公共卫生和食品安全的迫切任务。
成都大熊猫繁育研究基地与西南民族大学的研究团队针对这一难题，开展了 TaqMan 实时荧光定量 PCR（qPCR）方法的开发研究。该研究成果发表于《Scientific Reports》，为 DEC 的快速检测提供了突破性解决方案。
研究方法与技术路线
研究团队基于中国国家标准规定的毒力基因（invE、stx1、stx2、sth、stp、lt、aggR、astA、pic、bfpB、escV），从 NCBI 获取基因序列，通过序列同源性分析设计引物和 TaqMan 探针（5′端标记 6-FAM 荧光基团，3′端标记 BHQ1 淬灭基团）。实验采用标准菌株（如 ETEC CICC10667、EHEC CICC24187 等）和临床样本（来自大熊猫、小熊猫等动物的粪便、组织样本共 122 份），优化了 PCR 反应体系（引物浓度 3.5 pmol/μL、探针浓度 3-4 pmol/μL）和退火温度（57℃），并通过质粒梯度稀释确定检测灵敏度和构建标准曲线。
研究结果
引物与探针验证
通过常规 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳，证实 11 种毒力基因的 PCR 产物大小与预期一致，测序结果与目标序列匹配，表明引物设计成功。
方法特异性
对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等 11 种非目标菌进行检测，结果显示非特异性扩增的 CT 值均超过 35 个循环，其中 bfpB 和 stx2 基因在 40 个循环内无扩增，表明该方法特异性优异。
检测灵敏度
除 stx2 基因的最低检测限为1.60×102 copies/μL 外，其余基因检测限均为1.60×101 copies/μL，优于部分已报道的同类检测方法（如禽大肠杆菌 qPCR 检测限为1×102?4.69×102 copies/μL）。
标准曲线与扩增效率
各基因标准曲线的R2值在 0.999-1 之间，扩增效率为 98.4%-100%，表明线性关系良好，定量准确性高。
重复性验证
组内变异系数（CV）为 0.12%-0.88%，组间变异系数为 0.67%-1.62%，均低于 10%，显示该方法稳定性强。
临床样本检测
与传统 PCR 相比，qPCR 对 122 份临床样本的阳性检出率更高（29.5% vs 27.0%），尤其在 pic 基因检测中优势显著，且与国家标准方法结果高度一致。
研究结论与意义
本研究成功建立了针对 5 种 DEC 的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法，该方法具有高特异性、高灵敏度、良好重复性和高效扩增效率，可在数小时内完成检测，显著缩短了传统培养法的时间成本。其临床样本检测结果表明，该技术在野生动物（如大熊猫）的 DEC 感染监测中具有重要应用价值，为食源性疾病的快速诊断、疫情溯源和防控提供了可靠的技术支撑。尽管研究中发现部分基因荧光信号强度差异可能影响稳定性，且需注意避免 35 循环后的假阳性，但该方法仍为 DEC 检测领域的重要突破，未来有望转化为商业化检测试剂盒，进一步推动临床和食品安全检测的自动化与标准化。
