基于亚细胞分辨率空间转录组技术 PHOTON 的 RNA 分布与功能研究

为解析 RNA 亚细胞定位与功能关联问题，研究人员开发 PHOTON 技术，融合高分辨率成像与高通量测序实现亚细胞分辨率空间转录组分析。在卵巢颗粒细胞、核仁、线粒体及应激颗粒（SGs）中验证其效能，揭示 m?A 修饰调控 mRNA 入 SGs 机制，为亚细胞分子动态研究提供新平台。

　　

在生命科学领域，RNA 的 “空间密码” 一直是破解细胞功能的关键谜题。RNA 的亚细胞定位与其存储、加工、翻译及降解等命运紧密相关，例如应激颗粒（Stress Granules, SGs）中 mRNA 的选择性招募可调控细胞应激反应，核仁作为核糖体 RNA（rRNA）合成枢纽也参与炎症 RNA 降解。然而，现有技术要么局限于低通量成像（如 MERFISH、seqFISH 需设计大量探针且依赖专业设备），要么受制于生物化学分离法的高细胞投入和污染风险，尤其难以解析膜无细胞器如 SGs 的动态转录组。如何在保留空间背景的同时实现高通量、高分辨率的 RNA 分析，成为领域内亟待突破的瓶颈。

为攻克这一难题，美国德克萨斯大学西南医学中心（University of Texas Southwestern Medical Center）的 Haiqi Chen 团队开发了 PHOTON（Photoselection of Transcriptome over Nanoscale）技术，相关成果发表于《Nature Communications》。该技术创新性地将激光靶向光选与原位 cDNA 文库构建结合，实现了亚细胞级别的空间转录组 profiling，为解析 RNA 分布与功能网络提供了革命性工具。

研究采用的核心技术包括：1. 原位光笼 cDNA 文库构建，通过含光可裂解接头和 N-POM 修饰 dT 的定制逆转录（RT）引物，实现 RNA 的空间定位标记；2. 激光靶向光解，利用 405 nm 激光选择性激活目标区域（ROIs）的 cDNA，结合自动化图像分割实现数千个 ROIs 的高通量分析；3. 链霉亲和素磁珠纯化与 PCR 扩增，通过生物素标记和模板转换技术富集目标 cDNA，最终进行高通量测序。

结果分析

PHOTON 技术的可行性与性能验证

在 HeLa 细胞中，激光照射后荧光强度下降 86.9%±4.3%，证实光解效率。无逆转录酶对照组未生成文库，验证 RNA 依赖性。光笼机制效率达 99.1%±0.26%，且在低激光功率（2.5 mW）下仅 0.5% 细胞（25 个）被光解时，信噪比（SNR）仍 > 1.2，显示高灵敏度。激光参数优化表明，2.5 mW 功率与 100 μs dwell time 可平衡特异性与产量，适用于亚细胞级分析。

组织水平的空间转录组捕获

在小鼠卵巢组织中，PHOTON 成功捕获颗粒细胞（Granulosa Cells, GCs）转录组，两重复组相关性高。与传统机械分离法相比，PHOTON 检测到更多基因，且与 Slide-seqV2 空间转录组数据高度相关，证实其在保留组织微环境下精准解析目标细胞转录组的能力。已知 GC 标记基因 Inha、Nr5a2 等特异性高表达，而其他细胞类型标记基因未显著表达，验证了技术的细胞特异性。

亚细胞 compartments 的转录组分析

• 核仁：通过自动化图像分割光解核仁区域，发现富集小核仁 RNA（snoRNAs）及长非编码 RNA RMRP，与已知核仁功能一致。

• 线粒体：利用 MitoTracker 标记，PHOTON 鉴定出线粒体基因的特异性富集，揭示其动态网络中的转录组特征。

• 应激颗粒（SGs）：在亚砷酸钠和热激诱导的 SGs 中，PHOTON 检测到差异富集转录本，与传统纯化法数据重叠显著。HCR-FISH 验证显示 ZMIZ1、EP400 mRNA 与 SGs 共定位，而 AHNAK2、ZACN 无显著重叠，提示传统方法可能存在污染。此外，不同应激源诱导的 SGs 转录组存在差异，表明 SG 成分的应激特异性。

m?A 修饰调控 mRNA 入 SGs 的机制解析

结合 METTL3 抑制剂 STM2457 处理和 Mettl3 敲除细胞模型，发现 m?A 修饰缺失导致长 mRNA 向 SGs 的富集消失，证实 m?A 通过 YTHDF 蛋白介导长度依赖性 mRNA 招募。转录组分析显示，m?A 修饰水平与 SGs 富集呈正相关，且其作用独立于转录本长度，为 RNA 相分离机制提供了新证据。

结论与意义

PHOTON 技术突破了传统方法在亚细胞转录组分析中的瓶颈，实现了从组织微环境到单个细胞器的跨尺度空间解析。其无需遗传操作、高灵敏度及单细胞级分辨率的特性，为膜无细胞器、稀有细胞类型的研究提供了通用平台。通过 SGs 模型揭示 m?A 修饰的关键作用，不仅深化了对 RNA 定位机制的理解，也为应激相关疾病（如神经退行性疾病）的病理研究提供了新方向。未来结合长读长测序和人工智能图像分割，PHOTON 有望推动多组学空间分析的发展，助力基因表达调控的时空动态研究。