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为探究核肌动蛋白及成核因子调控同源重组（HR）的机制，研究人员对 DIAPH1 缺陷患者细胞展开研究。发现 DIAL 综合征患者存在 HR 修复缺陷，且 γ-actin 而非 β-actin 突变亦致修复异常，揭示 DIAPH1 与 γ-actin 通过促进 MRN 复合物重定位启动末端切除调控 HR。
在生命科学领域，DNA 双链断裂修复（DSBR）如同精密机器维护着基因组的稳定，一旦这一过程出现异常，就可能引发多种疾病。然而，核肌动蛋白和不同肌动蛋白成核因子如何调控同源重组（HR）这一关键修复途径，长期以来笼罩在科学的迷雾之中。更为有趣的是，临床观察发现，携带双等位基因突变的 DIAPH1 患者，其临床特征与 HR 缺陷疾病 —— 尼曼匹克破骨细胞综合征（NBS）和华沙断裂综合征（WABS）存在惊人的重叠，这暗示 DIAPH1 可能在 HR 调控中扮演重要角色，而其突变引发的部分临床缺陷或许源于潜在的 DSBR 缺陷。同时，巴雷特 - 温特脑额面综合征（BWCFF）患者中，ACTG1（γ- 肌动蛋白）突变患者与 ACTB（β- 肌动蛋白）突变患者表现出不同的临床特征，也为解开肌动蛋白在 DNA 修复中的奥秘提供了重要线索。在此背景下，来自英国伯明翰大学等机构的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上，为揭示 DSBR 的分子机制和相关疾病的病理基础带来了新的曙光。
为了揭开这些科学谜团，研究人员以 DIAPH1 功能丧失综合征（DIAL 综合征）患者和 BWCFF 综合征患者的细胞为研究对象，结合多种先进的实验技术，深入探究 DIAPH1 和肌动蛋白在 DSBR 中的作用机制。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是利用全外显子测序（WES）对患者进行基因检测，以确定 DIAPH1 等基因突变情况；二是运用免疫荧光显微镜技术，观察 γ-H2AX、53BP1 等 DNA 损伤修复标志物的焦点形成及 resolution，评估 DNA 双链断裂修复效率；三是借助超分辨率随机光学重建显微镜（STORM），监测 MRE11 等蛋白在 DNA 损伤位点的招募情况；四是通过姐妹染色单体交换（SCE）分析、微核形成和染色体断裂检测等方法，评估基因组稳定性；五是利用 CRISPR-based 同源重组（HR）修复效率检测系统，直接衡量 HR 修复功能。此外，研究还纳入了超过 30 例 DIAPH1 双等位基因突变患者的临床样本和细胞系，以及多种基因突变的细胞模型，为研究提供了丰富的样本基础。
DIAPH1 双等位基因突变导致具有一系列临床症状的神经发育障碍
通过对一名疑似 NBS 的患者进行全外显子测序，发现 DIAPH1 基因存在纯合移码变体 c.2108dupC；p.Pro704Thrfs。进一步对一组表现出与 SCBMS 重叠的神经和发育缺陷的患者进行 WES 分析，鉴定出 > 30 例 DIAPH1 双等位基因变体患者，临床症状包括小头畸形、智力障碍、视力障碍和癫痫等，部分患者还出现反复感染、甲状腺功能减退、淋巴 openia 及淋巴瘤。多数 DIAPH1 基因变体为纯合移码或无义突变，导致 DIAPH1 蛋白完全缺失，基于此，研究人员将该疾病重新命名为 DIAL（DIAPH1 功能丧失）综合征。
DIAPH1 促进 DNA 双链断裂修复
通过 Western blotting 检测 γ-H2AX 的动力学，发现 DIAL 综合征患者来源的成纤维细胞在 24 小时时仍保留 γ-H2AX，表明存在 DSBR 缺陷，该表型可通过外源性 WT DIAPH1 互补恢复。免疫荧光显微镜分析显示，患者细胞中 γ-H2AX 和 53BP1 焦点在暴露于 IR、CPT 和 ETOP 后残留水平升高，微核形成和染色体断裂增加，进一步证实 DIAPH1 在促进 DSBR 中的重要作用。
DIAPH1 是同源重组修复 DNA 双链断裂所必需的
通过在 G1 和 G2 期细胞中监测 γ-H2AX 焦点的分辨率，发现 DIAPH1 缺失特异性导致 HR 依赖性 DSBR 缺陷。SCE 分析和 CRISPR-based HR 检测显示，DIAL 综合征细胞和 DIAPH1 敲低的 HeLa 细胞中 HR 效率显著降低，且细胞中 BRCA1、RPA2 和 RAD51 焦点数量减少，表明 DIAPH1 在 HR 修复的早期阶段发挥作用。
DIAPH1 通过促进 MRN 复合物重新定位到 DSBs 来调节 DNA DSB 末端切除
STORM 显微镜观察发现，DIAPH1 缺失损害了 MRE11 向受损复制叉和周围染色质的重新定位，FokI 诱导的 DSB 实验也证实了这一点。AsiSI-ER U-2 OS 细胞的 qPCR 分析和原生 BrdU 焦点量化显示，DIAPH1 缺失导致 DSB 末端切除显著减少，表明 DIAPH1 通过促进 MRE11 依赖性 DSB 末端切除来调节 HR。此外，DIAPH1 可被招募到 DSBs，且与 MRN 复合物相互作用，ATM 和 MRE11 的抑制或缺失显著减少 DIAPH1 向 DSBs 的重新定位。
DSBR 需要 Arp2/3 复合物和 γ- 肌动蛋白而非 β- 肌动蛋白
对 BWCFF 综合征细胞系的分析发现，仅 ACTG1 突变患者的细胞表现出 DNA 损伤修复缺陷，γ- 肌动蛋白敲除的 A375 黑色素瘤细胞也显示出类似的修复缺陷，而 β- 肌动蛋白突变或敲除则无此现象。PLA 实验显示，DIAPH1 依赖性 γ- 肌动蛋白而非 β- 肌动蛋白在复制细胞中定位到 CPT 诱导的 DSBs 位点。此外，Arp2/3 复合物组分突变的患者细胞也表现出 DSBR 缺陷和基因组不稳定性。
DIAPH1 与 Arp2/3 复合物和 γ- 肌动蛋白共同促进 MRE11 依赖性 HR
GFP-Trap 实验显示，DIAPH1 与 γ- 肌动蛋白结合强烈，与 β- 肌动蛋白结合微弱，与 Arp2/3 复合物无结合。敲低 DIAPH1、γ- 肌动蛋白或 ARPC4 均影响 MRE11 向 DSBs 的重新定位，且联合敲低未进一步降低 HR 效率，表明三者在同一通路中发挥作用。CRISPR-based HR 检测显示，敲低 DIAPH1、γ- 肌动蛋白或 ARPC4 均降低 HR 效率，进一步证实它们共同促进 HR 依赖性修复。
这项研究首次将 DIAL 综合征确定为一种新的 DSBR 缺陷综合征，揭示了 DIAPH1 和 γ- 肌动蛋白通过与 Arp2/3 复合物协同作用，促进 MRN 复合物向 DNA 损伤位点的重新定位和末端切除，从而调控 HR 依赖性 DSBR 的分子机制。这一发现不仅为 DIAL 综合征、BWCFF 综合征与 NBS、WABS 的临床症状重叠提供了机制解释，也为理解核肌动蛋白在基因组稳定性维持中的作用开辟了新视角，更为相关疾病的诊断和治疗提供了潜在靶点。未来研究可进一步探索 DIAPH1 和 γ- 肌动蛋白在其他 DNA 修复途径中的作用，以及如何利用其缺陷开发针对性的治疗策略，为攻克因 DNA 修复缺陷引发的疾病带来新的希望。
