DG9增强PMO核内递送与外显子跳跃技术协同恢复杜氏肌营养不良症肌肉与心脏功能

本研究针对杜氏肌营养不良症(DMD)患者心脏疗效不足的临床难题，开发了基于细胞穿透肽DG9的磷酸二酰胺吗啉寡聚物(PMO)递送系统。通过hDMDdel45;mdx小鼠模型证实，DG9-PMO可显著提升外显子44跳跃效率，使骨骼肌和心肌分别恢复16%和41%的肌萎缩蛋白(dystrophin)表达，并改善β-异丙肾上腺素诱导的心肌损伤。该研究为同时靶向骨骼肌和心肌的DMD治疗提供了新策略。

　　

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)作为一种X连锁遗传病，每年影响约1/5000男性新生儿。该疾病由DMD基因突变导致肌萎缩蛋白(dystrophin)缺失，引发进行性肌肉退化。尽管外显子跳跃技术通过反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)恢复部分功能性肌萎缩蛋白表达，但现有疗法对心肌的改善效果有限，而心肌病正是DMD患者的主要死因。

针对这一临床痛点，阿尔伯塔大学的研究团队在《Nature Communications》发表创新性成果。研究聚焦于从人类多同源异型盒1(Hph-1)转录因子衍生的细胞穿透肽DG9，通过其与靶向外显子44的磷酸二酰胺吗啉寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer, PMO)偶联，在人源化DMD小鼠模型(hDMDdel45;mdx)中实现了骨骼肌和心肌功能的协同改善。该研究不仅阐明了DG9-PMO通过多种内吞途径增强核内递送的分子机制，更在动物模型中证实其显著优于临床标杆肽R6G的心脏保护效果。

关键技术方法包括：采用荧光标记追踪DG9-PMO在肌细胞中的时空分布；通过药理学抑制剂解析内吞途径；建立β-异丙肾上腺素诱导的心脏应激模型；利用hDMDdel45;mdx小鼠评估治疗效应；结合RNA测序分析转录组变化；采用Western blot和免疫荧光定量肌萎缩蛋白恢复水平。

DG9-PMO促进细胞摄取与核内定位
研究发现DG9-PMO在分化成熟的肌管和心肌细胞中呈现独特的核内聚集特征，核内定位比例达20%以上，显著高于未分化肌母细胞。机制研究表明，DG9-PMO通过网格蛋白依赖、小窝介导和巨胞饮等多条内吞途径进入细胞，其中肌母细胞以巨胞饮为主，而终末分化细胞则无显著偏好性。这种多途径内化特性解释了其在心肌细胞中长达24小时的持久滞留现象。

改善人源化肌营养不良小鼠表型
在hDMDdel45;mdx小鼠模型中，四周DG9-PMO治疗使前肢握力恢复至野生型水平，跑步机耐力提升13%。分子分析显示骨骼肌外显子44跳跃效率达10-12.3%，肌萎缩蛋白恢复16.8-21.2%，显著高于未处理组的3.5%和PMO组的6.7%。组织学分析发现膈肌中央核纤维减少，胫骨前肌出现45-50μm的大肌纤维，提示肌肉再生。

DG9-PMO恢复心肌功能并抵抗β-异丙肾上腺素损伤
单次高剂量β-异丙肾上腺素挑战显示，DG9-PMO处理组心肌退化面积仅2.4%，接近野生型(0.6%)，远优于未处理组(18%)。慢性应激模型中，治疗组维持正常射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)，而对照组EF下降13.8%。心肌肌萎缩蛋白恢复达41%，外显子跳跃效率超20%，形成43.4%的阳性纤维，建立显著的心脏保护效应。

安全性评估与炎症改善
血清分析显示DG9-PMO使天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸激酶(CK)恢复至正常水平，肾脏损伤标志物KIM-1无异常。骨骼肌CD68⁺炎症细胞减少至野生型水平，RNA测序显示治疗组下调炎症相关基因，上调肌肉收缩和钙稳态通路。

DG9-PMO对比R6G-PMO的心脏优势
头对头比较显示，虽然两者在骨骼肌疗效相当，但DG9-PMO在心脏的肌萎缩蛋白表达(5.3%)显著高于R6G-PMO(1.8%)，外显子跳跃效率达3倍差异(17.08% vs 5.5%)，确立了其在心脏靶向治疗中的优势地位。

转录组重塑效应
RNA测序揭示DG9-PMO使425个心肌差异表达基因中95%发生与人类iPSC心肌细胞一致的方向性改变。GO分析显示治疗上调心脏传导、肌肉收缩相关基因，下调炎症和凋亡通路，这种转录组"正常化"效应为理解其长期获益提供了分子基础。

这项研究突破了现有ASO疗法的心脏递送瓶颈，首次证实DG9-PMO可实现骨骼肌和心肌的协同治疗。其多途径内吞特性、卓越的心脏靶向能力和良好的安全性谱，为7%的适用DMD患者提供了转化医学解决方案。特别值得注意的是，该治疗在应激条件下保持心脏功能的能力，对于延缓DMD患者致命性心肌病的发生具有重要临床意义。研究建立的人源化小鼠模型与人类基因表达的高度一致性，进一步增强了研究成果的临床转化价值。