单细胞RNA测序鉴定的骨骼干细胞外泌体联合3D打印支架增强骨软骨再生的创新策略

为解决骨软骨缺损(OCDs)修复难题，研究人员通过单细胞RNA测序(ScRNA-seq)从髌下脂肪垫(IFP)中鉴定出具有强软骨分化潜能的骨骼干细胞(SSCs)，并提取其外泌体(Exos)与3D打印水凝胶支架结合。研究证实SSC-Exos通过miR-214-3p/JAG2轴显著促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的软骨分化，在动物模型中实现软骨与软骨下骨的同步再生，为无细胞治疗策略提供新思路。

　　

骨软骨缺损(OCD)是临床治疗的重大挑战，由于软骨无血管的特性，其自我修复能力极其有限。传统的治疗方法如微骨折手术和干细胞移植虽有一定效果，但存在供区损伤、细胞存活率低及疗效不稳定等问题。外泌体(Exos)作为细胞间通讯的关键媒介，虽具有低免疫原性和高效递送活性物质的优势，但单独应用时易被机体快速清除。如何突破这些限制，开发既能精准调控细胞分化又能实现长效缓释的治疗策略，成为再生医学领域的迫切需求。

针对这一难题，中南大学的研究团队在《Bioactive Materials》发表了一项突破性研究。研究人员首先通过单细胞RNA测序(ScRNA-seq)技术，从人髌下脂肪垫(IFP)中鉴定出一群具有独特表面标记物(PDPN⁺CD146^-CD73⁺CD164⁺)的骨骼干细胞(SSCs)。与常规脂肪来源干细胞(ADSCs)相比，这群细胞表现出更强的软骨分化潜能。通过流式细胞术分选和体外培养后，团队提取了SSCs分泌的外泌体(SSC-Exos)，并利用3D打印技术将其与甲基丙烯酰化明胶(GelMA)水凝胶结合，构建了具有空间结构的生物活性支架。

研究采用的关键技术包括：单细胞转录组分析鉴定IFP中的SSC亚群；流式细胞术分选和Exos超速离心提取；3D打印构建负载Exos的梯度支架；通过microRNA测序和双荧光素酶报告基因验证miR-214-3p/JAG2调控机制；建立大鼠OCD模型评估修复效果。

研究结果部分：

1. 通过ScRNA-seq鉴定IFP来源的SSCs
   单细胞测序分析显示，IFP组织中存在高表达PDPN、CD73和CD164的细胞亚群，基因富集分析证实这些细胞显著富集于软骨发育和骨骼系统形态发生相关通路。与皮下脂肪(SAT)来源的SSCs相比，IFP-SSCs表现出更强的软骨分化潜力，体外实验验证其能高效表达SOX9和II型胶原(COL2)。

2. SSC-Exos的分离与表征
   透射电镜显示SSC-Exos呈典型杯状形态，粒径分析显示主要分布在40-160nm范围。Western blot检测到外泌体标志物CD81、TSG101和CD63高表达。功能实验证实，SSC-Exos可被骨髓间充质干细胞(BMSCs)高效内化，并显著增强其软骨分化标志物表达。

3. 3D打印支架的制备与性能
   通过挤出式3D打印技术构建的GelMA支架具有规则的多孔结构，扫描电镜显示Exos均匀分布在纤维内部。流变测试证实支架具有良好的光交联性能（30秒内G′>G″）和剪切稀化特性。体外缓释实验显示28天内可持续释放80%的Exos。

4. SSC-Exos促进软骨再生的机制
   microRNA测序发现SSC-Exos中miR-214-3p表达水平显著高于ADSC-Exos。通过抑制剂敲低和模拟物过表达实验证实，miR-214-3p通过直接结合JAG2 mRNA的3'UTR抑制其表达，进而下调Notch信号通路，促进BMSCs向软骨细胞分化。双荧光素酶报告基因实验验证了二者的靶向关系。

5. 体内修复效果评估
   在大鼠OCD模型中，SSC-Exos支架组8周时缺损区域完全被新生组织填充，微CT显示骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)显著提高。组织学评分显示，该组国际软骨修复学会(ICRS)评分达到正常软骨的90%，且COL II和聚集蛋白聚糖(ACAN)表达水平接近天然组织。

讨论部分指出，该研究首次将单细胞技术、外泌体疗法和3D打印三大前沿技术有机结合：ScRNA-seq为发现具有特定功能的干细胞亚群提供精准工具；Exos克服了细胞治疗的存活率和异质性难题；3D打印支架则解决了Exos体内滞留时间短的问题。值得注意的是，IFP作为膝关节手术中的"副产品"，其临床可及性远高于传统骨髓或骨膜来源的SSCs，这使得该策略具有显著的转化医学价值。

研究也存在一定局限性：大鼠模型无法完全模拟人类OCD的复杂微环境；支架的力学性能仍需优化以适应承重需求。未来研究将聚焦于大型动物实验和临床级生产工艺开发。该工作为开发"无细胞"组织工程产品提供了全新范式，不仅适用于骨软骨修复，其技术路线也可拓展至其他难愈性组织再生领域。