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为解决白色生物技术中微生物代谢网络复杂等问题，研究人员探讨酶混杂性（催化多种反应、底物模糊性）。发现其可构建生产路径但也致代谢紊乱，机器学习或助优化微生物细胞工厂性能。
在全球迫切寻求可持续发展的背景下，传统依赖石化合成的模式正面临严峻环境挑战。白色生物技术作为一种极具潜力的可持续替代方案，有望通过微生物代谢网络将可再生碳源转化为生物基产品，从而缓解对化石燃料的依赖。然而，微生物自身经过漫长进化形成了复杂的 “领结型” 代谢网络，其核心目标是将碳和能量转化为细胞生长和稳态所需的组分，这与生物技术旨在高效生产生物产品的目标存在根本冲突。尽管代谢工程、合成生物学和系统生物学工具的发展为两者的平衡提供了可能，但基因和代谢干预常常引发意想不到的生理行为，其中一个重要原因是大量代谢酶具有 “混杂性”—— 它们除了催化进化过程中形成的天然反应外，还能催化其他非天然反应。这种特性如同双刃剑：一方面，它可能催生 “地下代谢”，为构建高性能生产路径提供新机会；另一方面，也可能导致代谢紊乱、天然与异源通路的负面串扰，甚至引发代谢损伤，造成产量损失。如何识别这些混杂酶并预见其在微生物细胞工厂工程中的利弊，成为提升生物生产性能的关键挑战。
为深入探究这一问题，相关研究人员开展了一系列研究，旨在阐明酶混杂性在白色生物技术中的作用机制，并探索应对策略。研究成果发表在《BioDesign Research》。
研究人员综合运用了多种关键技术方法。首先，借助计算生物学手段，如基于序列、结构和反应数据的支持向量机（SVM）模型、深度学习模型 SPEPP 等，预测酶的混杂性及潜在反应；其次，利用基因组规模代谢模型（如 E. coli iJO1366、iML1515）结合代谢通量分析（FBA），模拟和分析酶混杂性对代谢网络的影响；此外，通过适应性实验室进化（ALE）、多拷贝抑制筛选等实验方法，在微生物（如 E. coli、酵母）中验证酶混杂性驱动的代谢通路创新与修复机制。
酶混杂性的定义、预测与量化
酶混杂性包含催化混杂性（催化多种反应）和底物模糊性（底物特异性宽泛）。例如，D - 苹果酸脱氢酶既能作用于多种底物，又具有氧化脱羧活性。Khersonsky & Tawfik 提出，仅当酶对非天然底物的催化效率（kcat/KM）比天然底物低 100-10,000 倍时，才称为 “混杂性”，以区别于 “广谱特异性” 酶。计算工具如 PROMISE、SPEPP、PROPER 等通过分析序列特征、活性位点属性或代谢网络补偿机制，预测酶混杂性及地下反应。例如，SPEPP 利用深度学习整合底物 - 产物 - 酶三元组数据，可高通量预测酶催化潜力；PROPER 通过无监督学习在基因组水平识别 “靶标 - 替代” 基因对，预测直接或间接的代谢补偿路径。
酶混杂性在合成生物学中的应用
受自然进化启发，酶混杂性可作为创建新代谢功能的起点。例如，通过改造苯甲酰甲酸脱羧酶（BFD）和磷酸酮醇酶（PKT）的混杂活性，构建了仅需 3 步反应的合成乙酰辅酶 A（SACA）路径，实现了甲醛到乙酰辅酶 A 的转化。尽管体内催化能力较弱，但该路径具有碳守恒、不依赖 ATP 等优势。另一个案例是通过模拟天冬氨酸 - 高丝氨酸路径，将大肠杆菌天冬氨酸激酶（LysC）经三轮突变改造为苹果酸激酶，成功构建了合成非天然化合物 2,4 - 二羟基丁酸（DHB）的路径。此外，聚羟基脂肪酸酯（PHA）合酶经突变后可利用 D - 乳酰 - CoA 合成聚乳酸，拓展了生物基材料的合成范围。
地下代谢通路的发现与生物技术潜力
酶混杂性催生的 “地下代谢” 包括代谢泄漏和偶然通路（SPs）。通过多拷贝抑制筛选（如 ASKA 文库）和适应性实验室进化（ALE），研究人员在大肠杆菌中发现了多种绕过必需基因缺失的偶然通路。例如，在 pdxB 突变株中，通过过表达 thiG 或激活丝氨酸代谢相关酶（如 ThrB、SerA），形成了不依赖传统磷酸赤藓糖脱氢酶（PdxB）的维生素 B6（PLP）合成路径。ALE 实验表明，早期适应性突变主要集中在调控基因（如转录因子）或结构基因（如混杂酶），通过增强混杂酶表达或提升其催化效率，驱动代谢创新。例如，大肠杆菌在适应 D- Lyxose 或 DHB 等非天然底物时，单个结构基因突变（如 yihS、dldD）或调控基因组合突变（如 ygbJ、nanR 缺失）即可激活相应代谢通路。地下代谢模型的扩展（如整合 PROPER 预测反应的 iJO1366 模型）显示，其可增强 1,2 - 丙二醇等化合物的产量，并预测新的合成路径（如 1 - 丙醇合成），但需注意热力学限制和代谢毒性问题。
酶混杂性对生物生产路径的负面影响
酶混杂性可能通过代谢中间体分流、底物竞争和抑制性串扰损害生物生产效率。例如，大肠杆菌中广泛存在的磷酸酶会水解萜类合成路径中的磷酸化中间体，降低番茄红素产量；2 - 氧代 - 4 - 羟基丁酸（OHB）在 DHB 生产中被混杂性醛缩酶切割为丙酮酸和甲醛，导致中间体流失和甲醛毒性。此外，地下代谢产生的非天然中间体（如 3 - 羟基丙酸、4 - 羟基苏氨酸）可通过竞争性抑制关键酶（如苏氨酸脱氨酶 IlvA）或形成无效产物，干扰天然代谢网络。计算工具 MDFlow 通过整合 PROXIMAL 预测反应和 FBA 分析，可评估酶混杂性对代谢网络的干扰，例如预测异源路径中混杂酶数量越多，3 - 羟基丙酸产量损失越显著。
代谢损伤与修复机制
酶混杂性或自发化学反应可引发代谢损伤，产生有毒代谢物（如 4 - 磷酸赤藓糖、2 - 磷酸乳酸），抑制关键代谢酶。细胞通过代谢修复酶（如磷酸乙醇酸磷酸酶 PGP）或抢先酶系统应对损伤。例如，PGP 在哺乳动物、酵母和细菌中保守，可水解有毒磷酸化代谢物，维持糖代谢通量。酵母 pho13Δ 突变株因积累 4 - 磷酸赤藓糖抑制戊糖磷酸途径，意外提升了木糖转化为乙醇的效率，揭示了代谢损伤与生产性能的复杂关联。CD-MINE 数据库整合自发反应规则，预测非酶促代谢损伤，如大肠杆菌中邻氨基苯甲酸的自发衍生化，为代谢工程中规避毒性提供了新视角。
结论与展望
酶混杂性是白色生物技术中微生物代谢网络复杂性的核心特征之一，其双重作用（创新路径与代谢干扰）凸显了理性设计微生物细胞工厂的挑战与机遇。当前研究通过计算模型与实验验证相结合，初步揭示了混杂酶的结构 - 功能关系及地下代谢的动态机制，但对海量未知功能基因介导的代谢奇异性仍知之甚少。未来需依托生物铸造平台大规模采集酶 - 底物数据，结合机器学习解析酶混杂性的结构基础，将地下代谢预测整合到基因组规模模型中，并系统阐明代谢损伤 - 修复网络。这一跨学科研究将推动合成生物学从 “试错型” 向 “预测型” 进化，加速高效、可持续微生物生产体系的开发，为循环经济提供关键技术支撑。
