《Current Opinion in Biomedical Engineering》：Organoids and derived models to study the microenvironments of bacterial infections
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本综述聚焦类器官、干细胞衍生平面培养及微生理系统，探讨其在模拟感染微环境中的应用。通过模拟上皮屏障极性与分泌功能，解析病原体黏附、免疫信号传导及屏障破坏机制，为感染性疾病研究提供创新模型工具。
1. 引言
上皮组织作为覆盖人体器官的黏膜外层，其结构与功能因解剖位置而异，不仅参与消化、气体交换等生理过程，更通过屏障功能抵御病原体入侵。病原体可通过黏附分子侵入宿主细胞，触发炎症反应并改变细胞分泌，进而影响上皮两侧微环境。类器官等干细胞驱动模型较传统细胞系更复杂，能模拟上皮屏障功能。其来源包括成体干细胞（ASCs）、胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），ASCs 因易获取和保留组织特性常用于胃肠道研究，iPSCs 则适用于心脏、脑等取样困难组织。自类器官技术诞生以来，平面培养和微生理系统等衍生模型相继出现，平衡了通量与培养复杂性。
2. 研究感染微环境的方法
传统类器官模型具有基底外侧朝外、顶端朝内的极性。模拟感染路径时，可通过机器人系统显微注射病原体至管腔，或结合分解方案捕获腔内病原体，但注射技术难度大且可能引发局部炎症。也可通过反转细胞极性构建顶端朝外的培养模型。然而，这些方法因规模小和拓扑封闭，限制了对顶侧和基底微环境的分析，尤其是腔内内容物的研究。
类器官衍生的平面培养通过将类器官分解为单细胞或碎片，培养在具有多孔膜的 Transwell 插件上，分离顶端和基底外侧腔室，克服了上述限制。通过去除顶端培养基（“气提”）在气液界面（ALI）培养，可保留顶端分泌功能。ALI 技术最初用于模拟气道生理条件，现已成功应用于多种组织。平面培养因开放结构，便于研究感染的顶端微环境，其分泌的黏液（构成顶端微环境的重要成分）可捕获病原体，此类培养常被称为黏膜类器官（mucosoids）。此外，平面培养还可研究基底细胞因子分泌及与基质或免疫细胞的通讯。
微生理系统（又称芯片器官）将细胞培养在包含基质或内皮细胞、组织架构、营养流、信号分子和气体等生理特征的芯片上，最初使用商业细胞系，近年已开发出类器官衍生细胞模型。本文各章节将探讨类器官、平面培养和微生理系统在模拟顶侧和基底微环境感染中的应用。
3. 模拟感染：上皮屏障破坏
类器官细胞源于成体组织，保留了病原体黏附、内化分子及识别病原体并激活屏障感染应答的能力。小鼠子宫内膜类器官经显微注射建模沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）感染，该革兰氏阴性菌与子宫内膜异位症和不孕相关，感染通过招募 ZO-1 紧密连接蛋白和 β- 连环蛋白至入侵部位，破坏细胞极性和屏障功能。
小鼠类器官还用于研究注射的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）—— 一种引起食源性疾病的革兰氏阳性杆菌 —— 通过细菌内蛋白与宿主 E - 钙黏蛋白的相互作用穿越肠上皮。单核细胞增生李斯特菌利用 E - 钙黏蛋白循环通路，涉及动力蛋白介导的内吞作用和微管。后者通路抑制剂（如 dynasore 和秋水仙碱）可减少细菌易位，而关键细胞内运输蛋白 Rab11 对细菌基底外侧释放至关重要。
人源类器官衍生平面培养用于研究结肠聚集性大肠杆菌（EAEC）感染，该菌可引起腹泻和食源性暴发。通过从培养基中去除干细胞维持因子 WNT3A 和 RSPO1，诱导分泌黏液的杯状细胞分化。EAEC 利用菌毛亚基 AAF/II、鞭毛、分散素和普通菌毛实现宿主细胞黏附，这种硫酸肝素受体介导的黏附还依赖黏液层。类似的人平面培养模型用于研究弗氏志贺菌（Shigella flexneri）感染，该菌虽可通过破坏紧密连接进入顶端结构域，但更倾向于从基底外侧入侵并在宿主细胞质中复制，通过邻近细胞检测 IL-8 和其他促炎细胞因子，引发强烈炎症反应。
人支气管平面培养用于研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染，该菌是医院获得性肺炎的主要病原体。铜绿假单胞菌利用 VI 型分泌系统挤出杯状细胞并进入基底结构域。转座子插入测序进一步显示，其生物膜存活依赖糖和乳酸，而氨基酸直接来源于富含黏蛋白的宿主微环境。另一项研究通过人呼吸道平面模型的 RNA 测序，强调群体感应分子作为毒力因子在假复层原代上皮生物膜形成中的作用，体外数据与铜绿假单胞菌感染气道的临床样本数据对比，证实了该模型的可靠性。这些研究通过维持细胞极化和病原体识别等关键生理特征，展示了类器官衍生模型在体外重现病原体驱动的上皮屏障破坏的能力。
4. 模拟顶端微环境
接近上皮屏障的病原体微环境由黏膜相关微生物群和体液（如黏液、胆汁、唾液、尿液、眼泪）组成。为建立感染，病原体必须适应感染期间受细胞分泌影响的微环境。类器官衍生模型的极性和结构为研究感染的顶端微环境提供了新机会。
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）—— 一种与胃炎、溃疡和癌症相关的胃病原体 —— 是最早在类器官中建模的感染之一。利用 pH 敏感染料和实时 pH 显微传感技术，评估人胃类器官管腔中的盐酸分泌（胃杀灭细菌的主要防御机制）。类似地，人肠类器官管腔分析表明，大肠杆菌 RspoS 调节系统（对适应环境压力至关重要）介导细菌定植。
微生物群的保护作用在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）感染的小鼠肠类器官模型中得到体现。尽管该感染会破坏类器官，但嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的存在可减少这种破坏，表明共生菌的保护作用。在 iPSC 衍生的 ALI 培养模型（研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染，包含代表人类皮肤的真皮、皮下和复层鳞状表皮层）中，痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）对调节稳态和防止皮肤损伤起重要作用。
在 ALI 培养的人原代支气管上皮细胞分泌具有黏弹性和剪切变稀等保护力学特性的黏液，这对防止细菌渗透和响应蠕动至关重要。流变学分析（包括宏观和微观流变学）揭示黏液层力学特性，包括与人类病原体相互作用相关的微观异质性。顶端黏液的影响也在人胃黏膜类器官培养中得到体现，其黏液主要由黏蛋白 MUC5AC 和 MUC6 组成，炎症状态下会发生改变。当黏膜类器官用促炎细胞因子处理时，上皮细胞向黏液层分泌抗菌肽，尽管抗菌剂提供部分保护，但幽门螺杆菌定植后可逃避这种防御。这些上皮细胞的免疫活动凸显了顶端微环境在宿主 - 病原体相互作用中的重要作用。
微生理系统通过引入营养流和废物清除等生理特征，推进了顶端微环境建模，如胃类器官流芯片（GOFlowChip），该装置在延长人源类器官寿命的同时支持感染研究。通过结合流动与仿生建筑图案（如工程生长支架、激光消融混合细胞外基质或使用聚二甲基硅氧烷印章模塑），模拟肠腔结构，复制肠道中的腺体、绒毛和隐窝，进一步提升了肠腔建模水平，这些模型能够维持顶 - 基分隔，对研究寄生虫感染及感染与微生物群的复杂相互作用具有重要价值。
由于肠道微生物群是兼性或专性厌氧菌，管腔微环境的另一个重要方面是氧气分区。GuMI 生理组平台支持六个同时培养，具有独立控制的顶端和基底微环境，通过剥夺顶端腔室的氧气，可实现对氧气敏感的普拉氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）定植。类似地，在 3D 支架中纳入氧气梯度的系统可促进上皮 - 微生物群共培养，同时保留管腔曲率。
在肺芯片模型中，ALI 培养用于研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染，顶端分泌的肺表面活性物质对细菌入侵提供了显著保护。这些系统为研究感染的顶端微环境提供了前所未有的机会，持续纳入黏液、氧气、pH 和组织架构等关键顶端环境因素，将推动在接近体内条件下研究多种病原体和共生菌。
5. 模拟基底微环境
模拟感染期间的基底微环境对于理解上皮细胞如何通过趋化因子协调招募底层免疫细胞并激活内皮细胞和成纤维细胞等其他细胞类型的炎症反应至关重要。该环境富含细胞外基质并与血液相连，承载着对抗感染的协调反应。将类器官衍生系统与其他细胞类型共培养，可研究上皮细胞与其他基底黏膜细胞的相互作用。
人胃类器官与免疫细胞和幽门螺杆菌共培养，阐明了基底微环境中的复杂免疫相互作用，其中单核细胞衍生的树突状细胞（MoDCs）在免疫监视中起关键作用。MoDCs 的吞噬活性取决于感染严重程度，吞噬幽门螺杆菌感染细胞，后者相应分泌 CXCL1、CXCL16、CXCL17 和 CCL20。另一项研究利用人胃黏膜类器官与树突状细胞（DCs）共培养，揭示了幽门螺杆菌采用的复杂免疫逃避机制。ADP - 庚糖（一种细菌代谢物和脂多糖生物合成中间体）通过与 ALPK1 受体结合激活炎症，同时反常地抑制 DC 激活，导致 Th1 反应受损。涉及上皮细胞、DCs 和 T 细胞的顺序共培养系统表明，尽管幽门螺杆菌触发免疫识别和炎症，但宿主免疫反应不足，使其能够在胃中终身持续存在，除非用抗生素根除。
与中性粒细胞共培养的肠道模型阐明了对弗氏志贺菌感染的基本免疫反应，包括基底细胞因子分泌和中性粒细胞迁移到管腔 —— 这是没有顶 - 基分隔就无法观察到的反应级联。另一项与小鼠子宫内膜类器官的中性粒细胞共培养研究揭示，沙眼衣原体通过衣原体蛋白酶体样活性因子逃避免疫，限制中性粒细胞激活和细胞死亡。
人回肠类器官感染伤寒沙门氏菌血清型 Typhi、成纤维细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）的模型揭示了上皮 - 免疫细胞串扰，特别是 TNF-α、IL-18、IL-6 和 IL-23 的表达增加，该研究还提示表观遗传因素在塑造宿主免疫反应中的潜在作用。
共培养还揭示了共生细菌在维持肠道稳态中的益处。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）促进 DC 产生 IL-10（一种关键的抗炎细胞因子），但有趣的是，当肠类器官显微注射该细菌时，IL-10 产生减少，表明完整的上皮屏障阻碍免疫细胞刺激。此外，鼠乳杆菌（L. murinus）通过 TLR-2 刺激巨噬细胞释放 IL-10，保护肠上皮免受缺氧 - 复氧损伤。
更复杂的人源类器官血脑屏障（BBB）模型已开发成功，其中脑内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞在细胞外基质内自组织，该模型具有 BBB 的典型特性，如紧密连接形成、极化内皮层和选择性通透性，为研究伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）引起的莱姆病提供了生理相关平台，该系统展示了感染活性和屏障完整性丧失，为研究宿主 - 病原体相互作用和测试治疗方法提供了平台。
新进展将允许探索组织驻留免疫细胞的作用，这些细胞与 PBMCs 相比具有关键的表型和功能差异。最近一项结合肠类器官和驻留记忆 T 细胞的自体研究报告了驻留和血液来源的淋巴细胞迁移及与类器官相互作用的差异。随着共培养和细胞信号研究的进展，类器官衍生模型显著推进了细菌学和生理学知识，为研究宿主 - 病原体相互作用提供了独特机会，同时维持了细胞的特定结构。
6. 结论
多组学整合的出现将为更全面研究上皮与管腔微生物群的相互作用开辟新途径。新出现的小鼠组装体系统（尚未优化用于人类细胞）能够模拟上皮和基质组织区室之间的界面。越来越多的研究小组开始用单细胞测序、空间转录组学和蛋白质组学分析这些先进模型，以深入了解感染期间的细胞特异性反应和相互作用。
鉴于目前可用的培养技术广泛，平面培养因其可及性、可扩展性和适用于高通量药物筛选，仍然是研究上皮感染的必要手段。尽管微生理系统因纳入类似体内的条件（如氧合和营养流）而备受关注，但类器官衍生细胞的广泛应用仍不足。平面培养中微图案和生物打印的最新进展已证明能够在体外重现组织架构和感染持续性，在这些环境中添加其他细胞类型（免疫细胞、基质细胞或内皮细胞）可能是更好地模拟感染建模的微尺度组织组织的有前途方向。
