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为探究慢性低浓度 Cr (VI) 致病机制，研究人员对 Cr (VI) 诱导的衰老 L02 肝细胞（S-L02）分泌的 SASP 展开研究。发现其外泌体中 miR-10b-3p 高表达，可抑制正常肝细胞增殖，促进肝癌细胞生长迁移，机制与下调 PHLPP2 激活 PI3K/Akt 通路相关。
在环境污染与癌症发生的复杂网络中，重金属六价铬（Cr (VI)）的潜在危害一直是科学界关注的焦点。作为国际癌症研究机构（IARC）认定的 Ⅰ 类致癌物，Cr (VI) 不仅会引发皮肤炎症和基因突变，流行病学研究还表明其与饮用水污染相关的原发性肝癌风险显著升高。然而，长期以来，关于 Cr (VI) 如何通过慢性低浓度暴露推动疾病进程的机制，尤其是其与细胞衰老及相关分泌表型（SASP）的关联，仍存在诸多空白。细胞衰老作为一种细胞周期停滞状态，会伴随 SASP 的分泌，这些包含细胞因子、生长因子等的生物活性分子既能参与组织修复，也可能通过重塑肿瘤微环境促进癌症发展。因此，解析 Cr (VI) 诱导的衰老肝细胞所释放的 SASP 组成及其功能，成为揭示 Cr (VI) 致癌通路的关键一环。
为填补这一知识缺口，国内研究团队围绕 Cr (VI) 诱导的早衰老肝细胞（S-L02）展开深入研究，相关成果发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。研究聚焦于 S-L02 细胞外泌体中的微小 RNA（miRNA），旨在阐明其作为 SASP 成分在肝细胞与肝癌细胞互作中的角色及分子机制。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过 SA-β-gal 染色验证细胞衰老表型；利用超速离心法分离外泌体，并通过透射电子显微镜（TEM）和 Western blot（检测 CD9、CD63 标志物）进行鉴定；运用小 RNA 测序筛选差异表达的 miRNA，结合 qRT-PCR 验证表达水平；通过细胞转染（miR-10b-3p 模拟物、抑制剂）、细胞增殖与集落形成实验、Transwell 侵袭实验、流式细胞术分析细胞周期；借助荧光素酶报告基因实验验证 miR-10b-3p 与靶基因 PHLPP2 的直接结合；通过 Western blot 检测 PI3K/Akt 通路相关蛋白表达。
3.1 Cr (VI) 诱导 L02 肝细胞早衰老
通过每周 3 次、连续 4 周用 10 nM Cr (VI) 处理 L02 细胞，观察到细胞分裂速率下降，形态呈现体积增大、扁平化，空泡化程度加剧。SA-β-gal 染色显示衰老细胞比例显著增加，Western blot 检测到衰老相关蛋白 FN1、CLU、SMP30、GATA4 表达上调，证实 Cr (VI) 成功诱导肝细胞早衰老。
3.2 外泌体的分离与鉴定
从正常 L02 和 S-L02 细胞培养上清中分离的外泌体，经 TEM 观察均呈现典型的杯状形态，粒径分布符合外泌体特征（30-150 nm）；Western blot 显示外泌体特异性标志物 CD9 和 CD63 均呈阳性表达，确认外泌体分离成功。
3.3 外泌体差异表达 miRNA 分析
小 RNA 测序结果显示，S-L02 外泌体中有 32 种 miRNA 显著上调，其中 miR-10b-3p 表达量最高。GO 富集和 KEGG 通路分析提示，这些 miRNA 的靶基因参与 PI3K/Akt、mTOR 等与肿瘤相关的信号通路，初步表明 miR-10b-3p 可能作为 SASP 成分发挥作用。
3.4 miR-10b-3p 对正常肝细胞的抑制作用
将 miR-10b-3p 模拟物转染至 L02 和 S-L02 细胞后，qRT-PCR 证实其表达显著上调，且转染后的 S-L02 细胞分泌的外泌体中 miR-10b-3p 水平升高。共培养实验显示，miR-10b-3p 抑制两种细胞的集落形成能力，细胞生长曲线也表明其显著减缓细胞增殖速率，揭示了该 miRNA 对正常肝细胞的负调控作用。
3.5 miR-10b-3p 对肝癌细胞的促癌作用
与 S-L02 细胞共培养的肝癌细胞（HCC）表现出集落形成能力增强，转染 miR-10b-3p 模拟物的 HCC 细胞增殖速率显著加快，细胞周期分析显示 G0/G1 期细胞比例减少，S 期比例增加，表明细胞周期进程加速。此外，伤口愈合和 Transwell 实验证实 miR-10b-3p 显著提升 HCC 细胞的迁移和侵袭能力，凸显其促癌效应。
3.6 miR-10b-3p 的分子机制：靶向 PHLPP2 激活 PI3K/Akt 通路
通过生物信息学预测和荧光素酶报告基因实验，证实 miR-10b-3p 直接结合 PHLPP2 mRNA 的 3′UTR 区域，下调其表达。Western blot 显示，miR-10b-3p 模拟物转染的 HCC 细胞中，PHLPP2 蛋白水平降低，而 PI3K、磷酸化 Akt（p-Akt）表达升高，同时细胞周期抑制蛋白 p27、p21 和 FOXO3a 水平下降，Cyclin D1 表达上调。这表明 miR-10b-3p 通过抑制 PHLPP2，解除其对 PI3K/Akt 通路的负调控，从而促进 HCC 细胞增殖。
结论与意义
本研究首次揭示了 Cr (VI) 诱导的衰老肝细胞外泌体中 miR-10b-3p 作为 SASP 成分的双重作用：一方面抑制正常肝细胞增殖，另一方面通过靶向 PHLPP2 激活 PI3K/Akt 通路，促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这一发现不仅为 Cr (VI) 致癌机制提供了新视角，也为六价铬暴露相关肝癌的防治提供了潜在干预靶点（如 miR-10b-3p 抑制剂或 PHLPP2 激动剂）。尽管研究未完全分离外泌体与其他 SASP 成分的作用，但通过多维度实验证实了 miR-10b-3p 在 Cr (VI) 诱导肝损伤与癌变中的关键角色，为后续深入探索外泌体介导的细胞间通讯在重金属毒性中的作用奠定了基础。
