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针对 D - 甘露糖化学 / 酶法合成转化率低、分离复杂的难题，研究人员构建两步酶法路线，利用 Xanthomonas phaseoli 甘露糖异构酶等耦合反应，以 PolyP 等为底物，实现 D - 果糖 99% 转化，最终制得 D - 甘露糖，总产率 85.6%，为大规模制备提供新策略。
在甜味剂与功能糖的探索领域，D - 甘露糖作为一种天然六碳糖，因兼具低热量特性与潜在健康价值备受关注。然而，其传统化学合成或酶法合成路径面临两大瓶颈：一是转化效率低下，难以突破底物到产物的高效转化；二是下游分离工艺繁琐，异构体分离需耗费大量成本与精力，这使得大规模制备纯净 D - 甘露糖成为行业难题。为打破这一困境，亟需开发一条高效、经济且环境友好的合成路线，以满足食品、医药等领域对 D - 甘露糖日益增长的需求。
中国研究人员围绕这一挑战展开攻关，在《Food Bioscience》发表的研究中，构建了一种全新的两步酶法合成策略，为 D - 甘露糖的工业化生产开辟了新路径。
研究采用的关键技术方法包括多酶级联反应体系构建与生物分离技术。首先设计体外多酶级联通路，涉及四种关键酶：来自 Xanthomonas phaseoli 的 D - 甘露糖异构酶（XpDMI）、双歧杆菌的糖 1 - 激酶（BiNahK）、丹毒丝菌科细菌的多磷酸激酶（EbPPK）以及南极细菌 TAB5 的磷酸酶（TAB5AP）。通过大肠杆菌 BL21 (DE3) 表达系统实现这些酶的可溶性表达，并利用固定化金属离子亲和层析（IMAC）技术纯化。分离环节则通过离心澄清反应液、钙盐沉淀中间产物 Man-1-P，结合活性炭吸附脱盐实现目标产物纯化。
多酶级联反应合成 Man-1-P
研究设计 “一锅三酶” 反应体系，以 D - 果糖与多聚磷酸（PolyP）为底物，在腺苷三磷酸（ATP）或腺苷单磷酸（AMP）作为辅因子再生剂的作用下，通过 XpDMI 催化 D - 果糖异构化生成 D - 甘露糖，随后 BiNahK 与 EbPPK 耦合实现磷酸化，生成 1 - 磷酸甘露糖（Man-1-P）。通过优化底物浓度（D - 果糖 300 mmol/L）与辅因子用量（仅 0.5 mmol/L AMP，相当于 1/600 当量），实现 D - 果糖 99% 的高效转化。该体系利用 PolyP 作为磷酸供体，通过 PPK 催化的 ATP 再生机制，显著降低了辅因子消耗，提升了反应经济性。
Man-1-P 水解与 D - 甘露糖纯化
第一步反应液经离心去除菌体后，加入钙盐使 Man-1-P 以沉淀形式分离，随后通过 TAB5AP 催化水解生成 D - 甘露糖。粗产物经活性炭吸附脱除无机盐，最终获得纯净 D - 甘露糖。验证性实验显示，该路线可实现 11.1 g D - 甘露糖的制备，总产率达 85.6%，展现出从实验室到工业化放大的潜力。
研究建立的两步酶法工艺，以低成本的 D - 果糖与 PolyP 为主要底物，通过多酶级联反应与简便分离技术的结合，绕过了传统方法中棘手的异构体分离难题。“一锅法” 反应设计简化了操作流程，辅因子再生机制大幅降低了 ATP 等昂贵试剂的消耗，而钙盐沉淀与活性炭脱盐的组合则提供了一种高效低成本的纯化方案。该策略不仅为 D - 甘露糖的大规模生产提供了可行路径，其多酶级联与辅因子再生的理念也可推广至其他功能糖的合成领域，为生物催化在绿色化学中的应用提供了新范式。未来研究若能进一步优化酶的热稳定性与反应体系兼容性，有望推动该技术从实验室走向工业生产线，助力功能性糖类在食品添加剂、医药中间体等领域的广泛应用。
