功能性分子掩蔽的前药双特异性抗体设计：通过淋巴细胞共激活实现肿瘤精准治疗

针对T细胞双特异性抗体(T-bsAbs)治疗实体瘤时存在的T细胞浸润不足和过度激活导致的细胞因子释放综合征(CRS)问题，东京农业大学团队创新性地将抗4-1BB单链抗体(scFv)通过基质金属蛋白酶(MMP)识别序列连接至Ex3-scDb-Fc抗体，开发出可被肿瘤微环境特异性激活的"前药型"双抗。该设计在维持靶向EGFR/CD3功能的同时，通过释放的scFv提供适度共刺激信号，显著增强T细胞增殖和肿瘤杀伤效果，为实体瘤免疫治疗提供了新策略。

　　

在癌症治疗领域，免疫疗法正掀起一场革命风暴。T细胞双特异性抗体(T-bsAbs)作为明星分子，能同时结合肿瘤抗原和T细胞表面CD3，像"分子桥梁"般将免疫细胞精准导向肿瘤。然而这个"双刃剑"疗法面临两大困境：实体瘤中T细胞浸润不足导致疗效受限，而过度激活又可能引发致命的细胞因子风暴(CRS)。更棘手的是，靶向CD3的抗体可能误伤正常组织，就像"友军火力"般造成严重副作用。如何设计出既能精准激活肿瘤局部T细胞，又能避免全身毒性的"智能导弹"，成为研究者们亟待破解的难题。

东京农业大学农业与技术创新研究院的研究团队在《Journal of Biological Engineering》发表创新成果，他们巧妙地将抗4-1BB单链抗体(scFv)通过基质金属蛋白酶(MMP)识别序列连接至靶向EGFR/CD3的双抗Ex3-scDb-Fc上，构建出可被肿瘤微环境特异性激活的"前药型"双抗。这种设计如同给双抗装上"安全锁"——在正常组织中，scFv通过空间位阻屏蔽CD3结合域；到达富含MMP的肿瘤部位时，酶切释放scFv发挥共刺激作用，同时解除对CD3结合域的屏蔽，实现"双管齐下"的抗肿瘤效果。

研究采用四大关键技术：1)通过基因工程构建含MMP酶切位点的scFv-Ex3融合蛋白表达载体；2)使用Expi293表达系统进行重组抗体生产；3)采用胶原酶IV(含MMP-2/9活性)模拟肿瘤微环境酶切条件；4)结合流式细胞术、WST-8增殖实验和MTS杀伤实验评估功能。特别选用高分泌MMP的HT1080肉瘤细胞和A431表皮样癌细胞作为模型，同时以人胆管癌TFK-1细胞为对照。

设计制备scFv掩蔽双抗部分，研究者构建了四种变体：基础型scFv-MMP-Ex3、缩短连接子的scFv△K-MMP-Ex3、延长连接子的scFv-G4S-MMP-Ex3以及含HRV-3C蛋白酶位点的对照scFv-3C-Ex3。表达产量达4.2-7.9 mg/L，SDS-PAGE证实成功获得单体形式。AlphaFold3结构预测显示不同连接子导致scFv与Ex3空间排布差异，溶剂可及表面积(ASA)计算揭示scFv△K-MMP-Ex3的连接子更隐蔽，这为其后续优异表现埋下伏笔。

酶切特性评估部分，胶原酶IV处理实验显示scFv△K-MMP-Ex3在4小时内被高效切割，产生78 kDa的Ex3和27 kDa的scFv片段，而scFv-G4S-MMP-Ex3则出现非特异性断裂。流式结果令人振奋：未切割时，所有变体对T-LAK细胞的结合力仅为原始Ex3的30%-50%，酶切后恢复至90%以上；而对EGFR阳性的TFK-1肿瘤细胞结合力始终维持，证实了"肿瘤选择性激活"的设计理念。

功能验证部分展现精妙生物学效应：未切割的scFv△K-MMP-Ex3促T细胞增殖能力仅为Ex3的60%，但切割后反而超出原始Ex3 20%。在杀伤实验中，10 pM浓度下，切割后的双抗对TFK-1细胞抑制率达75%，较未处理组提高2倍。特别值得注意的是，当采用高分泌MMP的HT1080细胞时，10 fM的超低浓度即可引发显著杀伤，证实了该设计对肿瘤微环境的响应特性。

讨论部分指出，这种"一石三鸟"的设计：1)通过scFv空间位阻减少正常组织毒性；2)利用肿瘤高表达MMP实现特异性激活；3)释放的scFv提供适度共刺激避免过度激活。虽然当前抗4-1BB scFv的共刺激强度有待优化，但该研究开创性地将"功能分子掩蔽"与"微环境响应激活"相结合，为实体瘤免疫治疗提供了新范式。正如作者强调，这种模块化设计可灵活更换不同靶点的scFv和酶切位点，未来通过优化scFv克隆和连接子设计，有望发展出更精准的下一代免疫治疗前药。