三维高通量筛选技术发现靶向细胞内志贺氏菌的新型抗菌分子

本研究针对志贺氏菌(Shigella)耐药性严峻且缺乏有效疫苗的现状，开发了基于Caco-2细胞三维培养的高通量筛选(HTS)平台。研究人员通过优化微载体(Cytodex 3)培养体系，建立384孔板筛选模型，从50万化合物库中鉴定出12个具有细胞内杀菌活性的先导化合物。该研究为治疗多重耐药(MDR)志贺氏菌感染提供了新药开发起点，同时建立的3D-HTS技术可拓展应用于其他胞内病原体研究。

　　

在全球公共卫生领域，志贺氏菌感染每年导致1.65亿病例和110万死亡，是儿童腹泻的第二大病原体。更严峻的是，这个革兰阴性菌通过获得性耐药机制已对多数推荐抗生素产生抗性，被WHO列为重点防控病原体。传统抗菌药物研发面临两大瓶颈：一是针对胞内病原体的化合物需同时穿透宿主细胞膜和细菌外膜的双重屏障；二是二维单层细胞模型难以模拟真实感染环境且通量低下。面对这一"创新鸿沟"，亟需开发新型筛选策略来发现靶向志贺氏菌关键致病环节——细胞内寄生的特效药物。

为解决这一难题，GSK Tres Cantos实验室联合国际团队开发了革命性的三维高通量筛选系统。研究人员创新性地将肠道上皮细胞Caco-2培养在微载体珠(Cytodex 3)上，模拟肠道三维结构，建立384孔板筛选平台。通过优化感染复数(MOI=150)和侵袭时间(6小时)，结合纳米荧光素酶(nanoluc)报告系统，实现了对50万化合物的高效筛选。这项发表于《npj Antimicrobials and Resistance》的研究，最终鉴定出12个能特异性抑制胞内志贺氏菌繁殖的新型化合物，为抗击耐药菌感染提供了全新武器库。

关键技术包括：1）微载体三维培养系统优化，通过检测蔗糖酶(SUC)和碱性磷酸酶(ALP)活性验证细胞分化；2）建立携带nanoluc报告基因的S. flexneri SF_nanoluc菌株；3）自动化384孔板高通量筛选平台，结合Z'因子(>0.4)质量控制；4）正交验证实验包括纳米荧光素酶干扰试验和HepG2细胞毒性测试。

结果

高通量筛选(HTS) assay开发

通过比较单层与三维培养的Caco-2细胞分化标志物，证实微载体系统能维持ZO-1蛋白表达和紧密连接形成。优化后的参数使侵袭效率达0.083%，每个珠子携带约15个细菌。11种抗菌药的测试显示板内变异系数(CV)<10%，板间CV<15%，验证了方法的可靠性。

高通量筛选过程验证

使用1万化合物验证集确认筛选标准，Z'因子平均0.48。经结构分析排除已知抗菌类别后，获得204个活性化合物，其中4个显示剂量依赖性抑制，3个IC₅₀<10μM。

HTS primary screening campaign

大规模筛选518,282个化合物，初筛获得14,451个活性化合物(2.79%)，复筛确认2,283个(0.44%)。通过纳米荧光素酶干扰试验排除假阳性后，最终获得15个先导化合物，经毒性评估保留12个优质候选。这些化合物分子量多≤400，具有高渗透性和溶解性，其中4个含NO₂基团需进一步优化。

讨论与结论

该研究突破性地将三维细胞培养与HTS技术结合，解决了传统单层模型通量低、生理相关性差的局限。虽然微载体系统的细菌侵袭率较单层低，但通过增加珠子密度保证了筛选灵敏度。发现的12个先导化合物具有全新骨架，其中Series 2和Singletons系列尤其值得关注，它们不仅满足类药五原则(Lipinski规则)，还对肝细胞毒性低。

这项技术的意义远超志贺氏菌研究本身：首先，建立的方法可推广至其他胞内病原体(如沙门氏菌、结核杆菌)的药物筛选；其次，发现的化合物可作为化学探针研究细菌胞内生存机制；最后，研究揭示了针对革兰阴性菌双膜穿透的分子设计策略。随着耐药危机加剧，这种整合生理相关性与高通量的创新平台，将为抗菌药物研发开辟新路径。