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为探寻 APOE 基因中 E5 单倍型（R112–C158）是否存在及与阿尔茨海默病（AD）关联，研究人员对 355 例 APOE 2/4 基因型样本亚克隆测序，并对 11,647 例样本基因分型。结果未发现 E5，其出现概率极低，提示对 AD 风险影响极小。
论文解读
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作为一种严重威胁老年人健康的神经退行性疾病，其发病机制复杂，遗传因素在其中扮演着重要角色。载脂蛋白 E（Apolipoprotein E, APOE）是目前研究最为广泛的 AD 风险相关基因之一。APOE 基因存在常见的 E2/E3/E4 多态性，由 112 位半胱氨酸（C）/ 精氨酸（R）和 158 位精氨酸（R）/ 半胱氨酸（C）两个位点的单倍型决定。由于这两个位点存在强连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD），目前已知的三种主要单倍型（E2、E3、E4）已被广泛研究，而理论上存在的第四种单倍型 E5（R112–C158）仅在三个家系中偶有报道，其在普通人群中的分布情况及与 AD 的关系尚不明确。因此，系统探究 E5 单倍型的存在与否及其对 AD 风险的影响，对于深入理解 APOE 基因在 AD 中的作用机制具有重要意义。
为解决上述问题，美国匹兹堡大学公共卫生学院人类遗传学系的研究人员开展了相关研究。他们通过亚克隆、测序、全基因组测序（whole-genomic sequencing, WGS）及限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析等方法，对大量 APOE 2/4 基因型样本及普通人群样本进行检测，旨在明确 E5 单倍型的存在情况及其与 AD 的关联，研究成果发表在《Scientific Reports》。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：一是对 355 例 APOE 2/4 基因型样本（其中 17% 为黑人）的基因组 DNA 进行亚克隆，PCR 扩增 177 bp DNA 片段，构建单倍型克隆并测序；二是利用 TaqMan 法对 11,647 例样本进行 APOE 基因 rs429358（E4）和 rs7412（E2）位点的基因分型；三是对部分样本采用 RFLP 分析，使用 AflIII 和 HaeII 酶消化 PCR 产物，通过凝胶电泳检测 E5 单倍型。
研究结果
人口学特征及 APOE 基因型 / 等位基因频率
研究纳入 14,819 例样本，AD 病例中 APOE4 携带者（2/4、3/4、4/4 基因型）及 E4 等位基因频率显著高于对照组，而 APOE2 携带者及 E2 等位基因频率低于对照组。APOE 2/4 基因型虽同时携带保护性 E2 和风险 E4 等位基因，但仍为 AD 风险因素（OR=2.01, p=8.92×10-8）。
亚克隆与测序结果
对 340 例 APOE 2/4 样本亚克隆测序后发现，所有克隆仅显示 E2（T-T）或 E4（C-C）单倍型组合，未检测到对应 E5 的 C-T 组合，全基因组测序结果与之一致。
RFLP 分析结果
对 APOE 2/4 样本的 221 bp PCR 产物进行双酶消化，所有样本均未出现 E5 单倍型预期的 221 bp 未切割条带。部分样本出现的 faint 221 bp 条带经测序证实为不完全消化所致，而非 E5 单倍型。
重组与点突变概率估算
在连锁不平衡假设下，通过重组事件产生 E5 单倍型的概率为 3.31×10-8，通过复发点突变的概率为 5.58×10-8，两者数值相近，且均表明 E5 单倍型极罕见。
研究结论与讨论
本研究通过系统检测大量样本，未发现 APOE E5 单倍型（R112–C158）的存在，结合概率估算结果，证实 APOE 基因 112 位和 158 位位点间存在极强的连锁不平衡，E5 单倍型的出现为极罕见事件。这一结果进一步明确了 APOE 基因常见多态性的结构分布，排除了 E5 单倍型在普通人群中广泛存在的可能性，提示其对 AD 风险的影响极小甚至可忽略。
该研究的意义在于，一方面为 APOE 基因与 AD 关联的研究提供了更全面的遗传背景信息，验证了现有基因分型方法的可靠性；另一方面，有助于简化 AD 遗传风险评估模型，避免因考虑极罕见单倍型而增加不必要的复杂性。此外，研究结果对于理解 APOE 基因的进化及人群遗传结构差异也具有一定参考价值，为后续针对 APOE 常见单倍型的功能研究及 AD 个性化防治策略的制定奠定了基础。
