蜱传黄病毒耐外切核糖核酸酶 RNA 含双环结构 —— 解析黄病毒科 RNA 结构与抗病毒机制新突破

【字体：大中小】 时间：2025年05月16日 来源：Nature Communications 14.7

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　　针对黄病毒科病毒利用 xrRNAs 生成 sfRNA 逃避宿主 Xrn1 外切酶降解的机制未知问题，研究人员以 Powassan 病毒为模型，结合 cryo - EM、生化及生物信息学技术，发现其 xrRNA 含独特双环结构，为抗黄病毒药物开发提供新靶点。

在病毒与宿主的 “攻防战” 中，黄病毒科病毒堪称 “狡猾的侵略者”。这类包含 Zika 病毒、登革热病毒等致命病原体的家族，能通过产生亚基因组非编码 RNA（sfRNA）干扰宿主免疫反应。而 sfRNA 的形成依赖于病毒基因组中特殊的耐外切核糖核酸酶 RNA 元件（xrRNA），它们像 “分子路障” 一样阻止宿主 5'→3' 外切核糖核酸酶（Xrn1）降解病毒 RNA。然而，此前研究主要聚焦于蚊传黄病毒的 xrRNA 结构，对于蜱传黄病毒（TBFV）和无已知载体黄病毒的 xrRNA 三维构象却一无所知，这成为理解黄病毒生命周期和开发广谱抗病毒药物的关键瓶颈。

为填补这一空白，美国科罗拉多大学安舒茨医学校区（University of Colorado Anschutz Medical Campus）的研究团队以引发人类脑炎的蜱传 Powassan 病毒（POWV）为研究对象，开展了一项跨学科的深入研究。他们通过病毒学、生物化学、冷冻电镜（cryo - EM）及生物信息学等多维度技术，首次解析了蜱传黄病毒 xrRNA 的结构特征，相关成果发表在《Nature Communications》。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：

冷冻电镜（cryo - EM）：利用基于支架的方法将 POWV xrRNA 与 Tetrahymena 核酶融合，通过单颗粒冷冻电镜技术获得中等分辨率的三维结构图谱，观察其整体拓扑结构。
体外 Xrn1 抗性实验：通过体外转录的 POWV 3'UTR RNA 与 Xrn1 酶共孵育，结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，验证 xrRNA 对 Xrn1 的阻滞作用及 sfRNA 的生成。
化学探针分析（DMS - MaP 和 SHAPE - MaP）：运用甲基硫酸乙酯（DMS）和 1 - 甲基 - 7 - 硝基异氰酸苯酯（1m7）对 xrRNA 的二级结构进行化学修饰分析，揭示其构象动态。
生物信息学分析：基于 Infernal 程序对病毒基因组数据库进行搜索，鉴定新的 class 2 xrRNA 序列，并通过 R - scape 和 R2R 软件构建共变异模型，验证结构保守性。

研究结果

1. POWV 感染过程中 sfRNA 的生成及 xrRNA 的功能验证

通过 Northern blot 分析发现，POWV 感染 Vero 细胞后可产生两种离散的 sfRNA 条带（sfRNA1 和 sfRNA2），其大小与预期的 xrRNA1 和 xrRNA2 起始位置一致。体外 Xrn1 抗性实验表明，POWV 3'UTR 中的两个 xrRNA 元件能独立阻滞 Xrn1 酶的降解，且不依赖蛋白质辅因子，确认为 authentic xrRNA。这些结果为后续结构研究提供了可靠的模型。

2. POWV xrRNA 的外切酶阻滞位点特征

与 class 1 xrRNA 不同，POWV class 2 xrRNA 的 Xrn1 阻滞位点位于假结 1（PK1）内部。通过逆转录引物延伸技术 mapping 发现，xrRNA1 的阻滞位点分布在 PK1 的约 8 个核苷酸区域，xrRNA2 则集中在 3 个核苷酸处。这种 “非精确” 的阻滞模式提示 class 2 xrRNA 与 Xrn1 的相互作用机制可能更为复杂，涉及 PK1 结构的动态解旋。

3. POWV xrRNA 的二级结构特征及动态分析

化学探针实验显示，POWV xrRNA 的二级结构在病毒基因组、sfRNA1 和 sfRNA2 等不同环境中保持稳定。其包含典型的三螺旋 junction（P1、P2、P3 螺旋）和两个关键假结（PK1 和 PK2）。其中，PK1 长度显著长于 class 1 xrRNA（13 个碱基对），且在 PK1 的 5' 端存在动态构象，可能与 Xrn1 酶的解旋过程相关。突变实验证实，PK1 和 PK2 的完整性是 xrRNA 发挥功能的必要条件。

4. 冷冻电镜揭示 POWV xrRNA 的三维结构及与 class 1 的差异

通过冷冻电镜获得的 POWV xrRNA1 结构显示，其核心折叠与 class 1b xrRNA（如 TABV）相似，但具有独特的 “双环” 结构。传统 class 1 xrRNA 的环状结构仅环绕 RNA 5' 端一次，而 POWV 的 xrRNA 因 PK1 延伸形成双环，即 RNA 链两次环绕 5' 端，形成包含完整螺旋 turn 的扩展环。这种结构差异导致其与 Xrn1 酶的相互作用界面更为复杂，可能通过 “重塑环构象” 产生更强的空间位阻。

5. 生物信息学分析拓展 class 2 xrRNA 的保守特征

通过对 38 种 class 2 xrRNA 序列的共变异分析，证实了 POWV xrRNA 结构特征的普遍性，包括保守的三螺旋 junction、长 PK1、4 碱基对的 PK2 及关键碱基三联体（C⁺?G - Y）。此外，发现 class 2 xrRNA 中三个完全保守的腺嘌呤（A）碱基，突变实验表明其对维持 xrRNA 功能至关重要，可能参与形成非 Watson - Crick 相互作用稳定环状结构。

研究结论与意义

本研究首次解析了蜱传黄病毒 class 2 xrRNA 的三维结构，揭示其通过 “双环” 拓扑结构阻滞 Xrn1 酶的独特机制。研究发现，尽管黄病毒科 xrRNA 具有保守的核心折叠（如三螺旋 junction 和假结），但不同病毒通过调整环结构的大小和相互作用模式（如 class 1 的单环 vs. class 2 的双环），实现对宿主外切酶的抗性。这种结构多样性为理解黄病毒的进化适应性提供了新视角。

从应用层面看，xrRNA 作为黄病毒科普遍存在且细胞 RNA 中无类似结构的元件，是理想的抗病毒药物靶点。本研究明确了 class 2 xrRNA 的关键结构特征（如双环、保守碱基），为设计靶向该类结构的小分子抑制剂提供了结构基础。此外，冷冻电镜与生物信息学结合的研究策略，为解析其他复杂病毒 RNA 结构提供了方法论参考，有助于推动抗病毒研究从 “单一病毒靶向” 向 “家族共性干预” 的范式转变。

这项工作不仅填补了黄病毒 xrRNA 结构研究的空白，更通过揭示病毒利用 RNA 结构逃避宿主防御的 “聪明策略”，为开发广谱抗黄病毒药物开辟了新路径，对全球公共卫生应对新兴病毒性疾病具有重要意义。