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为阐明肽抑素（pepstatins）中他汀（statine）结构的生物合成机制，研究人员对其非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合成酶（PKS）基因簇展开研究。发现 PepI 作为 F???H?依赖的氧化还原酶，催化 β- 酮中间体串联还原，揭示了独特的他汀合成路径，为药物开发提供新视角。
论文解读
研究背景
肽抑素是一类强效的天冬氨酸蛋白酶（Aspartic Proteases, APs）抑制剂，在皮摩尔至纳摩尔浓度范围内就能有效抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶 D 等多种 APs。APs 广泛存在于生命三界和病毒中，在生理过程及多种疾病如 HIV/AIDS、高血压、阿尔茨海默病、疟疾和真菌感染的发病机制中起着关键作用，是极具潜力的治疗靶点。肽抑素作为线性 N - 酰基五肽，其两个（3S,4S）-4 - 氨基 - 3 - 羟基 - 6 - 甲基庚酸残基（即他汀，Sta）是与靶点结合的关键结构。然而，自放线菌中发现肽抑素以来，其生物合成途径，尤其是他汀亚结构的合成机制一直不明确。此前假说认为他汀的合成可能涉及非核糖体肽合成酶（Nonribosomal Peptide Synthetase, NRPS）和聚酮合成酶（Polyketide Synthase, PKS）模块的协同作用，其中 PKS 模块中的酮还原酶（Ketoreductase, KR）结构域负责 β- 酮基的还原，但这一假说尚未经实验验证。因此，揭示肽抑素及他汀的生物合成机制对于深入理解其作用原理、开发新型 APs 抑制剂具有重要意义。
为解决这一科学问题，德国亥姆霍兹感染研究中心（Helmholtz Centre for Infection Research）等机构的研究人员开展了相关研究，成果发表在《Nature Communications》上。
主要关键技术方法
研究运用了基因组测序、基因敲除与异源表达技术，如敲除 pepI 基因观察 β- 酮中间体积累，通过异源表达验证 pep 基因簇功能；采用超高效液相色谱 - 高分辨质谱（UPLC-HRMS）和核磁共振（NMR）进行化合物结构解析与中间体鉴定；利用蛋白质纯化与晶体学技术解析 PepI 及其与 F???复合物的结构；通过定点突变、氘标记辅酶实验等探究催化机制。
研究结果
肽抑素生物合成基因簇的鉴定
通过对链霉菌 Streptomyces catenulae DSM40258 的基因组测序，鉴定出一个非典型的 NRPS-PKS 杂合基因簇（pep BGC）。该基因簇仅有三个腺苷酸化（A）结构域，与传统共线性原则预期的五肽合成模块数量不符，提示存在非常规合成机制。基因敲除实验表明，pepD 基因（编码丙氨酸组装模块）缺失会完全消除肽抑素生产，证实其在生物合成中的必要性。异源表达实验进一步确认了该基因簇的功能，且发现 LuxR-like 转录调节基因 pepJ 对肽抑素产量有显著调控作用，过表达 pepJ 可使产量增加超 25 倍。
非共线性 NRPS-PKS 合成路径
pep BGC 的精简结构显示其 NRPS-PKS 模块数量少于肽链合成所需的构件数量，提示存在迭代使用机制。推测合成起始于 PepG 激活缬氨酸并通过 PepH 的 C 结构域进行反式负载，随后 PepB（亮氨酸激活模块）和 PepC（PKS 模块）协作引入丙二酰 - CoA 形成 β- 酮酰基物种，PepD 插入丙氨酸后，PepB 和 PepC 再次协作延伸脂肽骨架，这种跨蛋白的相互作用代表了一种不同于传统模块内作用的反式机制。
PepI 介导的 F???H?依赖型串联酮还原
pepI 基因缺失导致 β- 酮中间体（5-8）积累并自发脱羧为 9-12，表明 PepI 作为 F???H?依赖的氧化还原酶，在组装后阶段催化酮基还原。体外酶学实验显示，PepI 可顺序还原 β- 酮基，先形成中间他汀（Sta3），再还原 C 末端酮基生成完整他汀结构。时间进程实验证实，中间产物 13（仅中间酮基还原）先于终产物 17（双酮还原）出现，明确了还原顺序。
PepI 的结构与催化机制
解析 kvPepI（PepI 同源蛋白）及其与 F???复合物的晶体结构（分辨率 1.65?），发现其结构与 IF???依赖型酶相似，结合 F???后通过柔性环区稳定辅酶。关键残基 His62、Tyr122 和 Gln229 在催化中起重要作用：His62 作为质子供体，Tyr122 参与底物结合与第二次还原定向，Gln229 通过氢键稳定底物。氘标记实验证实氢化物直接从 F???H?转移至酮基碳，确定了立体选择性还原机制。
研究结论与意义
本研究揭示了肽抑素独特的生物合成路径，其通过离散的 F???H?依赖型氧化还原酶 PepI 介导他汀结构的串联还原，颠覆了传统 PKS KR 结构域依赖的假说。研究首次发现迭代使用的 F???H?依赖型氧化还原酶，拓展了 NRPS/PKS 生物合成的范畴，为理解含他汀类天然产物的合成提供了新模型。此外，对 PepI 催化机制的解析为靶向 APs 的药物设计提供了新靶点与理论依据，尤其在抗生素和抗肿瘤药物开发中具有潜在应用价值。该研究不仅填补了肽抑素生物合成领域的空白，也为微生物代谢工程和新型酶催化剂的开发奠定了基础。
