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为解析黏连蛋白（cohesin）环挤出动态及染色质状态的影响，研究人员利用 MNase-based 3D 基因组分析等技术，结合 CAMEL 工具定位 CTCF 足迹。发现全基因组完全挤出的 CTCF-CTCF 环罕见（~1–10%），且活跃染色质阻碍黏连蛋白挤出，为基因调控的拓扑机制提供新见解。
基因的三维空间排布是调控基因表达的关键因素，而黏连蛋白（cohesin）通过 “环挤出” 机制将远距离基因组区域拉近，形成拓扑相关结构域（TADs）等静态结构，在基因调控中扮演核心角色。然而，这些结构的动态变化过程 —— 如环挤出的频率、速率及影响因素 —— 长期以来并不清晰。例如，CTCF 作为黏连蛋白的锚定因子，其介导的环结构是静态为主还是动态变化？染色质的活跃状态（如转录活跃区域与静息区域）是否会影响黏连蛋白的挤出效率？这些问题制约着我们对基因调控网络和疾病发生机制的理解。
为破解这些谜团，哈佛大学公共卫生学院、达纳 - 法伯癌症研究所与麻省理工学院 Broad 研究所等机构的研究人员开展了深入研究。他们的成果发表在《Nature Communications》上，通过高分辨率技术揭示了黏连蛋白环挤出的动态特征及染色质状态的调控作用，为理解基因组空间组织与基因表达调控提供了关键线索。
研究团队采用了 MNase 消化 - based 的 3D 基因组分析技术，包括 MNase HiChIP 和 Region Capture Micro-C。前者通过微球菌核酸酶（MNase）消化染色质，结合免疫沉淀富集 CTCF 结合的 DNA，用于分析 CTCF 和黏连蛋白的定位及三维互作；后者则聚焦 CTCF 邻近区域，捕获特定基因组区域的相互作用。此外，他们开发了 CAMEL（CTCF Analyzer with Multinomial Estimation）工具，能以近碱基对分辨率识别 CTCF 足迹，精准定位 CTCF 结合位点。研究使用了 K562 细胞（人慢性髓系白血病细胞系）和小鼠胚胎干细胞（mESC），并通过黏连蛋白降解系统（degron strategy）验证关键结论。
结果
1. MNase 消化片段长度区分 CTCF 与核小体结合 DNA
MNase HiChIP 数据显示，CTCF 结合位点富集短片段（<80 bp），而核小体保护的 DNA 多为长片段（>120 bp）。短片段在 CTCF 基序中心形成双峰分布，通过 CAMEL 工具统计分析（计算α^=max(n1,n3)min(n2,n4)），可精准定位 CTCF 结合位点，精度达 5 bp，与 CUT&RUN 技术相当。
2. CTCF 与黏连蛋白共定位足迹的发现
在短片段中，部分 CTCF 结合位点下游存在延伸 15 bp 的足迹，提示黏连蛋白的存在。通过小鼠胚胎干细胞的黏连蛋白降解实验证实，该延伸足迹在黏连蛋白缺失后显著减弱，表明其为黏连蛋白与 CTCF 共定位的标志。携带该足迹的 DNA 片段更易参与长距离互作（>10 kb），暗示黏连蛋白在此类互作中起关键作用。
3. 全基因组完全挤出环的低频性
通过分析 CTCF / 黏连蛋白保护的片段，发现全基因组范围内完全挤出的 CTCF-CTCF 环频率极低，仅为 1–10%，平均 5%。这与活细胞成像在特定 TADs 中的观察结果一致，表明多数环处于 “部分挤出” 状态，而非静态锚定。
4. 染色质状态调控黏连蛋白挤出效率
染色质状态显著影响环挤出长度：静息区域（quiescent regions）的平均环长约 250 kb，是活跃区域（active regions，约 140 kb）的 1.75 倍。活跃区域中，H3K27ac（活性增强子标记）和 RNA Pol II 结合水平与环长呈负相关，提示活跃转录元件会阻碍黏连蛋白挤出。进一步实验显示，增强子与启动子间的互作依赖黏连蛋白，支持 “调控元件通过 Stall 挤出促进转录” 的模型。
结论与讨论
本研究突破传统静态环结构的认知，揭示黏连蛋白环挤出的动态本质：多数情况下，环以部分挤出状态存在，通过短暂互作促进增强子 - 启动子接触。染色质活跃状态（如转录、增强子活性）通过物理阻碍或分子互作干扰黏连蛋白运动，形成基因调控的时空特异性。这一发现完善了 “拓扑调控” 模型，即动态环结构而非静态锚定是基因表达调控的核心。
研究意义深远：其一，为理解 CTCF 和黏连蛋白在基因组折叠中的动态角色提供了全基因组证据；其二，揭示染色质状态与环挤出的关联，解释了不同细胞状态下基因调控的空间差异；其三，为相关疾病（如黏连蛋白功能异常导致的发育障碍或癌症）提供了新的机制线索。未来研究可进一步探索黏连蛋白与转录机器的互作细节，以及动态环结构在疾病中的异常调控模式。
