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为解决血液细胞外 RNA（exRNA）生物标志物研究中样本采集、处理及定量流程缺乏标准化的问题，exRNAQC 联盟系统评估 10 种采血管、3 种处理时间间隔及 8 种 RNA 纯化方法对血浆 / 血清中 miRNA 和 mRNA 转录组的影响，发现采血管和纯化方法显著影响结果，建议优化流程，为 exRNA 精准医学奠定基础。
在生物医学研究领域，液体活检作为一种微创的检测手段，正逐渐成为疾病诊断和监测的重要工具，其中细胞外 RNA（extracellular RNA, exRNA）作为潜在生物标志物备受关注。然而，目前 exRNA 研究面临一个关键挑战：不同研究中样本采集、处理和定量方法的差异极大，导致结果难以重复和比较。例如，血液采集管类型、血液处理时间间隔以及 RNA 纯化方法等预分析变量（pre-analytical variables）可能显著影响 exRNA 的检测结果，但这些影响尚未被系统评估。此外，现有研究多局限于 microRNA（miRNA）或少数基因的靶向分析，缺乏对全转录组范围的评估，且不同变量之间的相互作用常被忽视。因此，建立标准化的 exRNA 分析流程，明确预分析变量的影响，成为推动 exRNA 从实验室走向临床应用的关键。
为解决上述问题，比利时根特大学（Ghent University）的研究团队牵头组成的 exRNAQC 联盟开展了一项大规模研究。该研究系统评估了 10 种血液采集管、3 种血液处理时间间隔（0 小时、4 小时、16 小时或 24 小时、72 小时）和 8 种 RNA 纯化方法对健康供体血浆和血清中 miRNA 及 mRNA 转录组的影响，共生成 456 个完整转录组数据。研究成果发表在《Nature Communications》，为 exRNA 研究的标准化提供了重要依据。
研究主要采用以下关键技术方法：
- 样本采集与处理：从 20 名健康供体采集超过 1.6 升血液，使用 10 种采血管（包括 5 种经典管和 5 种保存管），并在不同时间间隔进行血浆 / 血清制备。
- RNA 纯化与测序：采用 8 种商业化 RNA 纯化方法（如 miRNeasy、QIAamp 等），结合 mRNA 捕获测序和小 RNA 测序，对纯化后的 RNA 进行深度转录组分析。
- 质量控制与数据分析：利用 189 种合成 Spike-in RNA 分子监控纯化和建库流程，通过 11 项性能指标（如 RNA 浓度、检测基因数、重复性等）评估不同变量的影响，并分析变量间的相互作用。
结果分析
1. RNA 纯化方法显著影响 exRNA 丰度和检测性能
不同纯化方法在 mRNA 和 miRNA 的检测数量、浓度及重复性上差异显著。例如，QIAamp 方法在大体积样本（4 mL 血浆）中检测到的 mRNA 数量最多，而 miRNeasy Advanced 在小体积样本（0.2-0.6 mL）中表现更优。此外，纯化效率高的方法（如 mirVana）未必能产生最佳定量结果，提示输入体积和洗脱体积的优化至关重要。研究还发现，mRNA 测序的变异性高于 miRNA，可能与多数方法专为 miRNA 设计有关。
2. 经典血液采集管优于保存管
尽管保存管旨在稳定核酸，但研究发现其性能并不理想。经典管（如柠檬酸盐管、EDTA 管）在 RNA 浓度稳定性、检测基因数及免疫细胞 RNA 比例稳定性上均优于保存管（如 RNA Streck、DNA Streck 管）。例如，保存管中 mRNA 和 miRNA 的丰度随时间变化显著（折叠变化 1.08-4.01），而经典管在 4 小时内处理时变化较小。柠檬酸盐管在 4 小时内处理时，基因表达谱最稳定，且免疫细胞组成无显著变化。
3. 预分析变量间存在关键相互作用
血液采集管类型与 RNA 纯化方法、处理时间的相互作用会影响检测结果。例如，柠檬酸盐管与 QIAamp 方法结合时，mRNA 浓度稳定性最佳；而 EDTA 管与 mirVana 方法联用可能导致 miRNA 检测偏差。此外，处理时间延长会增加基因表达的变异性，即使在高性能的经典管中，16 小时处理也会导致部分基因丰度显著变化。
结论与讨论
本研究首次全面系统地评估了 exRNA 分析中关键预分析变量的影响，揭示了血液采集管、纯化方法及处理时间对转录组谱的显著影响，并强调了变量间相互作用的重要性。研究结果表明，柠檬酸盐管（处理时间≤4 小时）结合 QIAamp（大体积）或 miRNeasy Advanced（小体积）纯化方法可作为 exRNA 分析的优选方案，而保存管因稳定性不足应避免使用。此外，研究提出的 11 项性能指标为方法优化和质量控制提供了标准化工具。
该研究的意义在于：
- 推动标准化：为 exRNA 研究提供了样本采集、处理和分析的具体推荐，有助于提升研究间的可比性和结果重复性。
- 指导临床应用：明确了适合长期生物样本库储存和临床检测的流程，为 exRNA 在癌症、心血管疾病等领域的生物标志物开发奠定了基础。
- 促进技术改进：为采血管和纯化方法制造商提供了优化方向，例如开发能稳定保存 exRNA 达 3 天以上的新型采血管。
尽管研究在单一实验室完成，但其大规模样本量和多变量分析框架为后续多中心验证提供了重要参考。随着 exRNA 研究的深入，标准化流程的建立将加速其向精准医学的转化，有望推动液体活检在疾病诊断、疗效监测和预后评估中的广泛应用。
