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本综述聚焦长读长测序（LRS）在传染病暴发应对中的应用，探讨其在病原鉴定、基因组流行病学、耐药性分析等领域的突破，分析技术优势与挑战（如误差率、计算瓶颈），展望未来与多组学结合及全球监测网络整合的前景，为公共卫生决策提供参考。
长读长测序（Long-read Sequencing, LRS）作为一项革命性技术，正深刻改变传染病暴发的应对模式。其核心优势在于能够生成连续、高保真的基因组序列，为实时解析病原体基因组特征提供关键支撑。
技术背景与最新进展
LRS 与以 Illumina 为代表的短读长测序技术不同，可产生数十至数百千碱基的超长读长，这使其在解析微生物基因组中高度重复和结构复杂区域（如结核分枝杆菌的插入缺失、疟原虫的端粒基因家族）具有显著优势。PacBio 的 HiFi 测序通过环形一致性测序（CCS）将错误率降至 1% 以下，接近短读长测序水平；牛津纳米孔技术（ONT）结合深度学习算法（如 Dorado、Bonito）实现 Q20+（99% 准确率）的碱基识别。在靶向富集技术方面，ONT 的 CRISPR-Cas9 引导无扩增富集、16S 条形码等方法可显著降低测序成本，提升宏基因组研究效率。
生物信息学的创新进一步释放了 LRS 的潜力。混合组装流程（如 Unicycler、Flye）整合短读长与长读长数据，提升基因组组装的连续性和准确性；基于云的分析工具（如下一代菌株追踪平台 Nextstrain）支持实时流行病学建模，助力公共卫生决策。
在传染病暴发中的多元应用
病原鉴定与基因组流行病学
LRS 的便携性使其在现场快速检测中发挥关键作用。2014-2016 年西非埃博拉疫情期间，ONT 的 MinION 测序仪实现了病毒基因组的数小时级测序，为追踪传播链和变异株识别提供了实时数据。在 COVID-19 疫情中，LRS 用于监测 SARS-CoV-2 变异株（如 Delta、Omicron）的演化，分析其传播力和免疫逃逸相关突变，指导疫苗策略调整。在资源有限地区，ONT 的低成本和便携性使其成为 Burkholderia pseudomallei（类鼻疽伯克霍尔德菌）等热带病原体监测的有力工具，通过优化核心基因组多位点序列分型（cgMLST），纳米孔测序与短读长测序的等位基因差异可控制在 2 个以内。
抗菌药物耐药性（AMR）分析
传统短读长测序难以解析质粒等复杂结构，而 LRS 可实现质粒全基因组组装，精准定位耐药基因。例如，ONT 测序无需短读长数据即可完成细菌和质粒基因组组装，揭示碳青霉烯酶产生菌的质粒转移动态。CRISPR 富集结合 LRS 的 Bac-PULCE 方法，可提升耐药位点的测序分辨率，即使未靶向的耐药基因也能被间接分析。在结核病领域，纳米孔测序通过多重 PCR 扩增耐药相关区域，12 小时内即可检测利福平、异烟肼等多种药物耐药性，显著优于传统培养方法的数周周期。
病毒进化实时监测与宏基因组应用
LRS 的实时测序能力使其成为病毒变异监测的核心工具。COVID-19 期间，LRS 实时追踪 SARS-CoV-2 的基因突变，为评估疫苗有效性提供依据；在寨卡病毒和流感病毒研究中，LRS 揭示了病毒遗传多样性与传播动力学的关联。宏基因组学方面，LRS 可直接测序复杂微生物群落，如冈比亚非人类灵长类动物的大肠杆菌分离株研究中，其揭示了质粒介导的水平基因转移在耐药性传播中的作用。
现存挑战与未来方向
尽管 LRS 优势显著，但其面临多重挑战：ONT 测序在均聚物、短串联重复序列和甲基化区域存在偏倚性错误，可能导致菌株分型不一致；数据分析需要高性能计算资源，在网络条件有限的地区难以实现实时处理；设备和试剂成本仍较高，限制了低收入国家的普及。
未来发展将聚焦于技术优化与全球整合：通过深度学习算法（如 RUBICON）进一步提升碱基识别准确率至 Q30+，利用 PCR 预扩增去除甲基化干扰；开发低成本便携设备（如 ONT 的 TraxION?）和开源分析平台（如下一代菌株追踪平台 Nextstrain），降低使用门槛。在标准化方面，需建立全球统一的测序流程和数据共享框架，结合区块链技术保障数据安全与透明性。
结论
长读长测序技术通过实时、高分辨率的基因组分析，为传染病暴发的监测、溯源和干预提供了革新性工具。尽管在准确性、成本和基础设施方面仍需突破，但其与人工智能、多组学技术的融合，以及全球监测网络的构建，将使其成为未来公共卫生应对的核心支撑，助力人类更有效地抵御新发和再发传染病威胁。
