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三阴性乳腺癌（TNBC）治疗手段有限，化疗副作用大且易耐药。本研究探讨毒性毛地黄苷 H（ToxH）诱导 TNBC 细胞铁死亡的作用及机制，发现 ToxH 通过上调 Nrf2/HO-1 通路诱导铁死亡抑制肿瘤生长，为 TNBC 治疗提供新方向。
三阴性乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌中恶性程度较高的亚型，约占所有乳腺癌的 15%-20%，因其缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体 2（HER2）表达，无法采用靶向治疗，主要依赖手术和化疗。然而，化疗存在显著副作用、易产生耐药性且疗效有限，TNBC 患者 5 年生存率不足 70%，迫切需要探索新的治疗策略。铁死亡作为一种铁依赖的程序性细胞死亡方式，通过活性氧（ROS）诱导脂质过氧化导致细胞死亡，与肿瘤的发生发展密切相关，诱导铁死亡成为潜在的肿瘤治疗新途径。在此背景下，海南医科大学第二附属医院暨热带病控制教育部重点实验室的研究团队开展了毒性毛地黄苷 H（ToxH）对 TNBC 细胞作用的研究，相关成果发表在《Discover Oncology》。
研究人员采用了多种关键技术方法：通过 CCK-8 和 EdU 实验检测细胞增殖能力；利用流式细胞术分析细胞死亡类型、线粒体膜电位、脂质过氧化水平及 Fe2?浓度；借助透射电子显微镜观察细胞超微结构变化；运用 Western blot 检测 Nrf2 和 HO-1 蛋白表达；构建小鼠肿瘤模型评估 ToxH 体内抗肿瘤效果。
3.1 ToxH 抑制 TNBC 细胞生长和增殖
CCK-8 和 EdU 实验显示，ToxH 对 BT-549 和 MDA-MB-468 细胞的增殖抑制呈剂量和时间依赖性，在 50-250μM 浓度范围内，200μM 和 250μM 时抑制率超 50%，150μM 处理不同时间点均显著降低细胞增殖活性。且 ToxH 对正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 无明显影响，表明其对 TNBC 细胞具有选择性抑制作用。
3.2 ToxH 诱导 TNBC 细胞死亡
流式细胞术和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验表明，ToxH 处理后，BT-549 和 MDA-MB-468 细胞的线粒体膜电位升高，7-AAD 阳性细胞比例和 LDH 释放量增加，呈剂量依赖性，而 MCF-10A 细胞未出现明显膜通透性改变和细胞死亡，说明 ToxH 特异性诱导 TNBC 细胞死亡。
3.3 铁死亡是 ToxH 诱导 TNBC 细胞死亡的主要形式
透射电子显微镜观察到 ToxH 处理后 BT-549 细胞线粒体皱缩、嵴消失，呈现铁死亡特征性形态。与凋亡抑制剂 Z-VAD、坏死性凋亡抑制剂 Nec-1、自噬抑制剂 3-MA 相比，铁死亡抑制剂 Fer-1 显著减少 ToxH 诱导的 7-AAD 阳性细胞比例和 LDH 释放，降低脂质过氧化水平和 Fe2?浓度，证实铁死亡是主要死亡方式。
3.4 ToxH 通过 Nrf2/HO-1 通路诱导铁死亡
Western blot 显示，ToxH 处理后 BT-549 和 MDA-MB-468 细胞中 Nrf2 和 HO-1 蛋白表达呈剂量依赖性上调。敲低 HO-1（shHO-1）可显著抑制 ToxH 诱导的 7-AAD 阳性细胞增加、脂质过氧化和 Fe2?生成，表明 Nrf2/HO-1 通路在 ToxH 诱导的铁死亡中起关键作用。
3.5 ToxH 在体内抑制 TNBC 肿瘤生长
小鼠肿瘤模型显示，ToxH（50mg/kg/day）显著抑制 BT-549 和 MDA-MB-468 肿瘤生长，而联合 Fer-1 可部分逆转这一作用。肿瘤组织中 Nrf2 和 HO-1 表达在 ToxH 处理后显著升高，且 ToxH 对小鼠体重、重要器官无明显毒性，表明其体内抗肿瘤效果显著且安全性较高。
研究表明，ToxH 通过上调 Nrf2/HO-1 通路诱导 TNBC 细胞铁死亡，从而抑制肿瘤生长，为 TNBC 治疗提供了一种潜在的天然化合物。铁死亡作为新型治疗靶点，ToxH 的作用机制为开发高效低毒的 TNBC 治疗药物开辟了新方向，其临床转化价值值得进一步深入研究。
