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为解决褐藻多糖高聚合度限制应用的问题，研究人员对 Alteromonas sp. A1-6 来源的海藻酸裂解酶 Alg0392 开展研究。发现其属 PL17 家族，具双功能酶活性，耐有机溶剂，产物含抗氧化寡糖，为褐藻资源利用和寡糖制备提供新途径。
褐藻作为重要的生物质资源，其细胞壁成分海藻酸（由 α-L - 古洛糖醛酸（G）和 β-D - 甘露糖醛酸（M）通过 1,4 - 糖苷键连接而成的线性酸性多糖）因高聚合度、高黏度等特性，限制了其在生物燃料、医药、食品等领域的应用。将海藻酸降解为低分子量的海藻酸寡糖（AOS）可显著提升其应用价值，例如具有抗氧化、抗肿瘤、神经保护等生物活性。然而，传统化学和物理降解方法存在成本高、副产物多等缺点，因此利用海藻酸裂解酶（通过 β- 消除非还原端 C4 和 C5 之间的 1,4 - 糖苷键降解海藻酸，生成不饱和寡糖）的生物催化方法成为研究热点。目前，多数已报道的海藻酸裂解酶为内切酶，兼具内切和外切活性的双功能酶较少，且耐有机溶剂的酶资源稀缺，限制了其在工业复杂环境中的应用。
为挖掘高效的海藻酸降解酶资源，武汉轻工大学生命科学与技术学院的研究人员从海藻酸降解菌 Alteromonas sp. A1-6 中克隆并表征了新型海藻酸裂解酶基因 alg0392，相关研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过实时定量 PCR（qRT-PCR）验证 alg0392 基因在藻酸盐诱导下的表达差异；利用 Ni-NTA 琼脂糖亲和层析纯化重组酶；借助薄层层析（TLC）和液质联用（LC-MS）分析酶解产物；采用铁离子还原能力（FRA）法测定抗氧化活性；通过酶动力学分析确定米氏常数（Km）、最大反应速率（Vmax）等参数。
1. 菌株生长与基因表达
Alteromonas sp. A1-6 在以海藻酸为唯一碳源的培养基中，72-144 h 进入对数生长期，168 h 达生物量峰值，表明其能有效利用海藻酸生长并产酶。qRT-PCR 显示，藻酸盐诱导组的 alg0392 基因表达量显著高于琥珀酸对照组，初步证实该基因与海藻酸降解相关。
2. 酶的生物信息学分析
Alg0392 基因全长 2214 bp，编码 737 个氨基酸，N 端含 15 个氨基酸的信号肽，预测分子量 83 kDa，等电点 4.89。系统发育树显示其属于 PL17 家族，与 Saccharophagus degradans 的海藻酸裂解酶同源性最高（37.75%）。保守结构域分析表明，其含 N 端 Alg Lyase 超家族结构域和 C 端 HeparII/III 结构域，催化位点（His190、Tyr264、Tyr456）和底物结合位点（Gln134、Asn137 等）保守，进一步确认其属于 PL17 家族。
3. 酶的表达纯化与动力学参数
重组酶经 IPTG 诱导表达并纯化后，SDS-PAGE 显示其分子量与预期一致。酶动力学分析表明，其对海藻酸的Km为 3.772 mg/mL，Vmax为 0.102 μmol/min，催化常数（Kcat）为 87.775 s?1，显示出较高的催化效率和底物亲和力。
4. 酶学性质分析
- pH 与温度特性：最适 pH 为 6.0，在 pH 6.0-9.0 范围内孵育 1 h 后活性保持 90% 以上；最适温度 30 ℃，5-30 ℃下孵育 30 min 活性维持 90% 以上，45 ℃以上活性显著下降。
- 金属离子与有机溶剂影响：低浓度（1 mmol/L）的Mn2+、Mg2+、Ca2+无显著影响，高浓度（5 mmol/L）的Co2+、Cu2+可完全抑制酶活。该酶对有机溶剂表现出优异耐受性，20%（v/v）甲醇或 DMSO 处理后，相对活性仍超 70%，显著优于多数已报道酶。
- 底物特异性：对聚甘露糖醛酸（polyM）的特异性活性最高（48.152 U/mg），其次为海藻酸（30.557 U/mg），对聚古洛糖醛酸（polyG）活性最低（11.902 U/mg），表明其为 polyM 特异性裂解酶。
5. 酶解产物分析
TLC 和 LC-MS 显示，海藻酸经 Alg0392 降解后，短时间内生成二糖、三糖及 DP 4-6 的寡糖，长时间反应则以单糖为主；polyM 降解产物最终几乎全为单糖，而 polyG 降解产物较少。此外，产物中检测到不饱和单糖 4 - 脱氧 - L - 赤藓糖 - 5 - 己糖醛酸（DEH），证实该酶兼具内切（生成寡糖中间体）和外切（释放单糖）活性。酶解产物的抗氧化活性随反应时间增强，24 h 时总抗氧化能力达 2.547 mmol/g，表明其在天然抗氧化剂制备中的潜力。
6. 研究结论与意义
本研究从海洋细菌中发掘了一种新型双功能海藻酸裂解酶 Alg0392，其独特的内切 - 外切协同活性可高效降解海藻酸生成低聚糖和单糖，且对有机溶剂和 pH、温度等环境因素具有较强适应性。与已报道的 PL17 家族酶（如 AlgSH17、Aly23）相比，Alg0392 在底物亲和力、催化效率和溶剂耐受性方面表现更优，尤其在工业预处理常用的甲醇、乙醇等溶剂中保持高活性，为褐藻多糖的高效利用提供了新工具。其降解产物的抗氧化活性进一步拓展了在功能性食品和医药领域的应用前景。该研究不仅丰富了海藻酸裂解酶的资源库，也为褐藻生物炼制和高附加值寡糖产品开发奠定了理论基础，有望推动相关绿色生物制造产业的发展。
