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流感病毒威胁全球公共卫生，MDCK 细胞是生产流感疫苗的主要细胞系。研究人员探究 USP1 在 MDCK 细胞中对流感病毒复制的调控作用，发现 USP1 通过去泛素化稳定 RIG-I 蛋白，抑制病毒复制，为构建高产疫苗细胞系提供理论依据。
流感作为由流感病毒感染引起的常见呼吸道传染病，每年的流感大流行都给全球公共卫生带来巨大威胁。目前，流感疫苗是预防和控制流感病毒感染最有效的手段，而 MDCK（Madin-Darby 犬肾细胞）因其对流感病毒高度敏感、感染效率高、操作成本低、增殖迅速且不易突变等优势，成为全球公认的流感疫苗生产的主要细胞系之一。然而，如何进一步提高病毒在 MDCK 细胞中的复制水平以提升疫苗生产效率，仍是亟待解决的问题。此外，深入理解病毒感染和复制的调控机制，对于人工构建高产疫苗细胞系至关重要。在此背景下，西北民族大学的研究人员开展了关于 USP1（泛素特异性肽酶 1）在 MDCK 细胞中对甲型和乙型流感病毒复制调控作用的研究，相关成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过慢病毒转染技术构建 USP1 过表达和敲低的 MDCK 稳定细胞系；利用 RT-qPCR 和 Western blot（WB）技术检测基因和蛋白表达水平；采用 TCID50 法测定病毒滴度；运用免疫共沉淀（Co-IP）、荧光共定位实验和蛋白质组学分析等技术探究 USP1 与 RIG-I（视黄酸诱导基因 I）的相互作用及调控机制。
流感病毒感染诱导细胞内 USP1 表达
通过蛋白质组学分析发现，甲型流感病毒 H3N2 感染 MDCK 细胞 12 小时后，USP1 蛋白表达水平显著上调。进一步通过 RT-qPCR 和 WB 检测发现，四种流感病毒（H1N1、H3N2、BV、BY）感染 MDCK、A549 和 HEK-293 细胞后，USP1 的 mRNA 和蛋白水平均有不同程度的升高。此外，用低分子量 poly (I:C) 或 VSV 刺激 MDCK 细胞，也能显著诱导内源性 USP1 的表达，提示流感病毒可能通过激活 RIG-I/MDA5 介导的抗病毒信号通路诱导 USP1 表达。
USP1 过表达抑制流感病毒在 MDCK 细胞中的复制
构建 USP1 过表达的 MDCK 细胞系后，RT-qPCR 和 WB 结果显示 USP1 的 mRNA 和蛋白水平显著升高。感染四种流感病毒株后，TCID50 测定显示 USP1 过表达显著抑制了甲型流感病毒 H1N1 和乙型流感病毒 BY 的复制，同时病毒 NP 和 NS1 基因的 mRNA 及蛋白表达水平也明显降低。
USP1 敲低促进流感病毒在 MDCK 细胞中的复制
设计靶向 USP1 mRNA 的 shRNA 抑制其表达，成功构建 USP1 敲低的 MDCK 细胞系。感染实验表明，USP1 敲低显著促进了流感病毒 NP 和 NS1 基因的表达及病毒复制，而细胞增殖实验显示 USP1 敲低对 MDCK 细胞的增殖和克隆形成率无显著影响，仅细胞迁移能力略有变化。
USP1 正向调节 RIG-I 蛋白水平
通过低分子量 poly (I:C) 刺激实验发现，USP1 过表达时 RIG-I 受体介导的信号通路下游的 IFN、ISGs（干扰素刺激基因）及 IL-1、IL-6 等炎症因子表达显著上调，而 USP1 敲低时则下调。进一步研究发现，USP1 对 TBK1 及磷酸化 TBK1 的蛋白水平无显著影响，但能显著影响 RIG-I 的蛋白表达，且 MG132 处理后 RIG-I 蛋白水平变化不大，提示 USP1 可能通过去泛素化稳定 RIG-I 蛋白。
USP1 与 RIG-I 相互作用并通过去泛素化稳定 RIG-I 表达
免疫共沉淀和荧光共定位实验证实 USP1 与 RIG-I 在细胞内存在相互作用。泛素化分析显示，USP1 过表达显著降低 RIG-I 的总体泛素化水平，尤其是 K48-linked 泛素化，而 K63-linked 泛素化无明显变化。功能恢复实验表明，在 USP1 敲低的细胞中过表达 RIG-I 能显著抑制病毒复制，进一步验证了 USP1 通过稳定 RIG-I 蛋白增强宿主抗病毒免疫应答。
研究结论表明，USP1 通过介导 RIG-I 去泛素化稳定其蛋白表达，激活下游 NF-κB 信号通路，从而增强宿主的先天免疫应答，抑制甲型和乙型流感病毒在 MDCK 细胞中的复制。而 USP1 敲低可促进病毒复制且不影响细胞增殖，提示 USP1 可作为靶基因用于构建高产流感疫苗的 MDCK 细胞系。该研究不仅深入揭示了 USP1 在抗病毒免疫应答中的作用机制，为理解宿主与病毒相互作用的分子机制提供了新视角，也为人工构建高产疫苗细胞系、提高流感疫苗生产效率奠定了重要的理论和方法基础，在流感疫苗研发和生产领域具有潜在的应用价值。
