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《Research》：Microdroplet-Engineered Skeletal Muscle Organoids from Primary Tissue Recapitulate Parental Physiology with High Reproducibility

【字体：大中小】 时间：2025年05月16日 来源：Research 8.3

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　　为解决现有体外骨骼肌模型成熟度、功能及一致性不足等问题，研究人员利用级联微流控技术（CTM）开发液滴工程化骨骼肌类器官（DEOs）。发现 DEOs 8 天内成熟，具良好肌节结构、收缩功能及纤维类型重现性，为肌肉研究和药物筛选提供高效模型。

在生命科学与医学领域，骨骼肌相关研究一直面临着体外模型难以精准模拟真实生理特性的挑战。现有的二维细胞模型和传统三维组织工程方法，要么无法还原复杂的三维微环境及基因表达谱，要么存在通量低、一致性差等问题。例如，基于多能干细胞（PSC）的模型需长达约 2 个月的分化时间，且表型重现不足；而依赖手动操作的非工程化类器官（NEOs）则因几何限制导致细胞分布不均、功能异质性显著。此外，许多肌肉疾病如杜氏肌营养不良（DMD）、肌萎缩侧索硬化等缺乏有效治疗手段，亟需能准确反映肌肉生物学和疾病机制的体外模型。

为突破这些瓶颈，清华深圳国际研究生院的研究人员开展了相关研究，旨在开发一种高通量、高重现性的骨骼肌类器官模型。研究团队利用级联微流控技术（CTM），成功构建了源自原代组织的液滴工程化骨骼肌类器官（DEOs），并在《Research》上发表了相关成果。该研究通过优化微流控参数和培养条件，使 DEOs 在 8 天内即可成熟，显著缩短了传统模型需 50-60 天的周期，且能高度重现亲本肌肉的纤维类型、肌节结构及收缩功能，为肌肉疾病研究和药物开发提供了新工具。

研究主要采用了以下关键技术方法：

级联微流控技术（CTM）：利用聚四氟乙烯（PTFE） tubing 构建微流控通道，通过 T 型 junction 实现油相和水相的汇聚，生成均一的微滴状类器官前体，单次实验可从少量组织样本制备数百个 DEOs。
原代细胞分离与培养：从小鼠腓肠肌等肌肉组织中通过机械和酶消化法分离原代骨骼肌细胞，无需体外扩增，直接嵌入基质胶（Matrigel）进行三维培养。
功能分析技术：采用电刺激平台（ES plate）结合 MUSCLEMOTION 算法量化收缩幅度，通过免疫荧光染色（如 MF20、Myh7 等抗体）和 RNA 测序（RNA-seq）分析基因和蛋白表达，利用流式细胞术（FACS）鉴定细胞组成。

研究结果

1. 类器官的构建与结构特征

DEOs 通过 CTM 技术生成约 0.1 μl 的微滴前体，经 3D 打印至培养板后，8 天内形成椭圆状结构，具均匀的细胞分布和一致的尺寸（直径约 500 μm）。相比之下，手动制备的 NEOs 因体积较大（10 μl），细胞自聚集形成环状或多菌落结构，中央区域细胞密度低，肌纤维空间分布异质性显著。免疫荧光显示，DEOs 的肌节（sarcomere）结构清晰，与亲本组织类似，且能重现 Ⅰ 型（Myh7⁺）、ⅡA（Myh2⁺）和 ⅡB（Myh4⁺）肌纤维类型的基因和蛋白表达。

2. 成肌分化与功能成熟

RNA-seq 和 RT-qPCR 分析表明，DEOs 中成肌分化标记基因（如 Myod1、Myog）和卫星细胞标记（Pax7）表达显著高于 NEOs，且再生相关基因（如 Myh3、Myh8）上调，反映其向再生肌肉表型的分化轨迹。DEOs 可自发收缩并响应电刺激，表现出频率依赖性收缩（1-5 Hz）、波总和（wave summation）及强直收缩（tetanic contraction）等特征，收缩模式与天然骨骼肌一致。此外，DEOs 对乙酰胆碱（Ach）等神经肌肉递质有显著反应，验证了其功能完整性。

3. 高通量生产与疾病模型应用

CTM 平台可从单只小鼠的腓肠肌组织制备超 500 个 DEOs，满足多组学分析和药物筛选需求。在药理模型中，DEOs 对心肌毒素（cardiotoxin）、丹曲林（dantrolene）及辛伐他汀（simvastatin）等药物表现出浓度依赖性毒性反应，模拟临床肌毒性病理。在代谢疾病模型中，高糖（HG）处理的 DEOs 显示葡萄糖摄取减少、乳酸脱氢酶（LDH）释放增加及自噬体（autophagosome）积累，重现糖尿病肌肉功能障碍的特征。