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本研究开发并评估了一种结合分子血培养鉴定（BCID）和微生物实验室自动化（MLA）的快速药敏试验（RAST）工作流程，用于大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌血培养阳性标本。该流程最快 6 小时可提供结果，多数抗菌药物分类一致性超 90%，为优化菌血症治疗提供新方向。
研究背景与目的
革兰阴性杆菌高耐药性导致菌血症死亡率高，传统药敏试验（AST）需 36-48 小时，而快速鉴定技术已实现 2 小时内完成。2019 年欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）发布基于纸片扩散法（DD）的快速药敏试验（RAST）协议，结合微生物实验室自动化（MLA）和数字成像技术可进一步优化流程。本研究旨在开发并评估针对大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）血培养阳性标本的 RAST 工作流程，结合分子血培养鉴定（BCID）和 MLA 系统，提升药敏结果的时效性和准确性。
材料与方法
研究设计与样本
研究于 2020 年 2 月至 2021 年 6 月在纽约纪念斯隆凯特琳癌症中心进行，纳入经 BCID-GN panel 鉴定为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌或铜绿假单胞菌的单菌血症血培养阳性标本，排除多菌感染、QC 失败或储存超 24 小时的样本，最终纳入 91 例（大肠杆菌 36 例、肺炎克雷伯菌 34 例、铜绿假单胞菌 21 例）。
实验流程
血培养瓶经 BD BACTEC FX 仪器培养，阳性后分装至 Vacutainer 管，通过 WASPLab MLA 系统制备革兰染色和亚培养。BCID-GN panel 检测病原体及耐药基因（如 CTX-M、KPC 等）。RAST 参照 EUCAST 协议改良，使用 150 μL 培养物作为接种物，均匀涂布于 Mueller-Hinton（MH）琼脂平板，放置 12 种抗菌药物纸片（部分药物浓度调整），分别于 4、6、8 小时通过 WASPLab 数字成像系统拍摄图像，利用 Halo 软件测量抑菌圈直径，以自动化微量肉汤稀释法（aMBD）和标准纸片扩散法（DD）为对照，计算分类一致性（CA）和误差率（mE、ME、VME）。
结果
总体表现
大肠杆菌和肺炎克雷伯菌多数抗菌药物在各时间点 CA＞90%，主要误差集中在哌拉西林 / 他唑巴坦（CA 71%-86%）和环丙沙星（4 小时 CA 85%）。铜绿假单胞菌 CA 普遍＜90%，多数结果落入技术不确定区（ATU），仅阿米卡星（CA 90%-95%）、美罗培南（CA 89%）和环丙沙星（CA 75%）可评估。
时间与误差关系
随培养时间延长，误差率降低。大肠杆菌和肺炎克雷伯菌 4 小时 ME 为 6%-20%，8 小时降至 2%-11%；铜绿假单胞菌环丙沙星误差率稳定在 25%。Halo 软件测量需调整的比例为 17.5%-27.8%，主要因软件低估抑菌圈边缘，调整幅度中位数 2 mm。
方法比较
与 aMBD 相比，RAST 在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中总体 CA 为 86%-95%，与标准 DD 法结果相似。CLSI 短期培养断点（8-10 小时）应用时误差率升高，可能与断点差异有关。
讨论与结论
本研究建立的 RAST 工作流程结合 BCID 和 MLA，可在血培养阳性后 6-8 小时提供初步药敏结果，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的多数抗菌药物 CA＞90%，符合 CLSI 可接受标准。哌拉西林 / 他唑巴坦的低 CA 可能与药物剂型（100/10 μg vs EUCAST 推荐的 30/6 μg）和对照方法误差有关。铜绿假单胞菌因 ATU 率高，RAST 性能受限，需进一步优化。
MLA 系统通过自动化接种、培养和成像简化流程，Halo 软件结合 AI 提升测量效率，但仍需人工审核调整。本研究首次在非人工加菌标本中验证该流程，为临床快速优化抗菌治疗提供依据，未来可结合 CLSI 新断点和 AI 算法进一步提升准确性。
研究局限性包括样本量小、铜绿假单胞菌 ATU 率高，以及改良流程可能影响结果。但该工作流程为整合新兴技术（如分子鉴定、自动化检测）于 RAST 提供了重要参考，有望缩短菌血症患者的精准治疗时间。
