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本文聚焦肌球蛋白（Myosin）静息态调控肌肉收缩及基础代谢的机制，针对 mantATP 追踪技术在评估超松弛态（SRX）等时的可靠性争议，结合实验与计算机模拟，剖析信号组成，验证分析方法，为相关研究提供关键方法学参考。
肌球蛋白（Myosin）是骨骼肌中负责将 ATP 能量转化为机械功的主要运动蛋白。在静息状态下，肌球蛋白存在两种 ATP 周转速率不同的生化状态：超松弛态（Super Relaxed State, SRX）和无序松弛态（Disordered Relaxed State, DRX）。SRX 与抑制性复合体的结构特征 —— 相互作用头基基序（Interacting Heads Motif, IHM）紧密相关，而 DRX 的构象则更为模糊。mantATP 追踪实验是鉴定这些生化状态的常用方法，其原理是通过荧光 ATP 类似物 mantATP 的水解和释放动力学来反映肌球蛋白的状态。
然而，该技术的可靠性近年来受到质疑，尤其是在可溶性肌球蛋白制备中。为此，研究以保留天然粗丝结构和肌球蛋白协同性的去膜纤维为模型，结合实验数据和计算机模拟，解析 mantATP 追踪信号中不同成分的贡献。研究发现，去膜纤维中的非特异性 mantATP 结合信号（Nonspecific Signal, NSP）约占初始荧光发射的 60%，其动力学与 DRX 的时间尺度部分重叠，可能导致快循环肌球蛋白群体的高估。
通过蒙特卡洛模拟不同分子内和分子间协同性假设对 mantATP 水解的影响，发现即使在热力学平衡状态下，肌球蛋白头部的协同作用也可产生多指数荧光衰减。其中，分子内协同性（如同一二聚体中受阻头和自由头的状态相互影响）和分子间协同性（如相邻二聚体间的状态相互作用）均会显著改变荧光衰减的时间常数和群体分布。
进一步通过 “幽灵纤维”（Myosin 被提取的纤维）实验和质谱分析证实，非特异性信号主要来源于游离核苷酸和与结构蛋白、其他 ATP 酶（如肌浆网钙 ATP 酶 SERCA）的结合。结合反应 - 扩散模型，研究比较了双指数、三指数拟合及结合非特异性信号校正的三种数据分析方法，发现三指数拟合结合独立测定的 NSP 可更可靠地估算 SRX 和 DRX 的群体及时间常数，尤其在 SRX 群体较高时优势显著。
最后，通过哌啶碱（Piperine）诱导 SRX 失稳的实验验证，发现校正 NSP 后的分析方法能更准确地反映静息态 ATP 消耗速率，解决了追踪参数与 ATP 酶速率之间的矛盾。该研究为正确开展 mantATP 追踪实验及可靠分析结果提供了方法学指导，有助于深入理解肌球蛋白静息态的能量代谢机制，在药物开发和临床评估等领域具有重要意义。
