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为探究爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）的免疫逃逸机制，研究人员开展其分泌的溶菌酶抑制剂 IvyEp 对宿主 C 型溶菌酶抑制作用的研究。发现 IvyEp 通过竞争性抑制阻断酶活性位点，显著降低宿主溶菌酶活性，且缺失ivy基因菌株毒力下降，为鱼类抗菌免疫提供新方向。
在水产养殖的蓬勃发展中，鱼类细菌性疾病始终是制约产业健康前行的一大难题。爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）作为一种革兰氏阴性兼性厌氧胞内寄生菌，广泛侵袭包括牙鲆（Paralichthys olivaceus）在内的多种鱼类，引发爱德华氏菌病，导致患病鱼体出现体色发黑、腹腔膨胀、肠道脱垂出血等严重症状，给全球水产养殖业造成巨大经济损失。宿主的先天免疫系统是抵御病原菌入侵的第一道防线，其中溶菌酶作为重要的抗菌效应分子，在鱼类防御革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌过程中发挥关键作用。脊椎动物中主要存在 C 型和 G 型溶菌酶，牙鲆感染爱德华氏菌后，其头肾、脾脏等器官中的 C 型溶菌酶（如 rLyzC）表达显著上调，试图通过降解细菌细胞壁肽聚糖来清除病原体。然而，病原菌在与宿主长期的博弈中，进化出了复杂的免疫逃逸策略。已有研究表明，细菌分泌的溶菌酶抑制剂 Ivy 可通过结合溶菌酶活性位点抑制其功能，但来源于爱德华氏菌的 IvyEp（Ivy derived from E. piscicida）能否直接抑制宿主 C 型溶菌酶活性，以及其在病原菌致病过程中的作用尚不明确。为揭开这些谜团，日本研究人员围绕 IvyEp 开展了一系列研究，相关成果发表在《Aquaculture》上，为深入理解病原菌与宿主互作机制及开发新型抗菌策略提供了重要依据。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：构建ivy基因缺失的爱德华氏菌突变株，通过浸泡感染牙鲆和日本青鳉（Oryzias latipes）模型评估菌株毒力变化；利用大肠杆菌表达系统制备重组 IvyEp 蛋白（rIvyEp）和重组牙鲆 C 型溶菌酶（rLyzC）；通过溶菌酶活性抑制实验、动力学分析、共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation）及结构预测等手段，解析 IvyEp 对 C 型溶菌酶的抑制机制。此外，研究还涉及多种鱼类血清溶菌酶样活性检测，以验证 IvyEp 抑制作用的广谱性。
抑制 HEWL 溶菌活性的研究
通过 IPTG 诱导携带 IvyEp 基因的大肠杆菌转化子表达带有 His 或 FLAG 标签的 rIvyEp 蛋白，经 SDS-PAGE 和 Western blot 分析显示，目的蛋白在约 17 kDa 处出现条带，且存在于裂解物的可溶性部分。利用 rIvyEp 对 HEWL（母鸡卵清溶菌酶，C 型溶菌酶典型代表）的溶菌活性进行抑制实验，结果证实 IvyEp 可显著抑制 HEWL 的溶菌活性。动力学分析表明，IvyEp 作为竞争性抑制剂，通过与底物竞争结合 HEWL 的活性位点，降低酶促反应速率。
ivy缺失株的毒力评估
在日本青鳉和牙鲆感染模型中，ivy基因缺失的爱德华氏菌突变株表现出毒力显著下降的现象。这一结果表明，IvyEp 在病原菌逃避宿主免疫攻击和致病过程中扮演关键角色，缺失该基因后，病原菌无法有效抑制宿主溶菌酶活性，导致其感染能力减弱，进一步证实了 IvyEp 作为毒力因子的重要性。
对鱼类血清溶菌酶样活性的抑制
检测 IvyEp 对牙鲆、黄尾鰤（Seriola quinqueradiata）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）血清中溶菌酶样活性的影响，发现 IvyEp 可显著抑制这些鱼类的血清溶菌酶活性，提示其对不同鱼类的 C 型溶菌酶具有广谱抑制作用。进一步利用纯化的 rLyzC 进行实验，结果显示 IvyEp 能有效抑制 rLyzC 的溶菌活性，直接验证了其对宿主 C 型溶菌酶的抑制效应。
作用机制的结构分析与结合验证
结构预测显示，IvyEp 通过静电相互作用结合到 rLyzC 的活性位点，阻碍底物与酶的结合，从而使 rLyzC 功能失效。共免疫沉淀实验直接证实了 IvyEp 与 HEWL 及 rLyzC 的特异性结合，从分子水平阐明了 IvyEp 通过直接结合宿主溶菌酶发挥抑制作用的机制。
综合研究结果表明，爱德华氏菌分泌的 IvyEp 通过竞争性结合宿主 C 型溶菌酶（如 rLyzC）的活性位点，阻断酶与底物的相互作用，显著抑制溶菌酶的抗菌活性，帮助病原菌逃避宿主的先天免疫防御，从而增强自身致病性。ivy基因缺失导致菌株毒力下降，进一步确认了 IvyEp 在病原菌致病过程中的关键毒力因子地位。此外，IvyEp 对多种鱼类 C 型溶菌酶的广谱抑制作用，提示其可能是革兰氏阴性鱼类病原菌中普遍存在的免疫逃逸工具。该研究不仅揭示了爱德华氏菌与宿主互作的新机制，为深入理解鱼类病原菌的致病机理提供了重要理论依据，也为开发靶向 IvyEp 或溶菌酶通路的新型抗菌策略、防控鱼类细菌性疾病开辟了新方向。未来研究可进一步探索 IvyEp 与其他宿主免疫因子的相互作用，以及其在不同病原菌中的保守性，为水产养殖病害防治提供更全面的解决方案。
