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为探究 Bradyrhizobium japonicum USDA110 含铜亚硝酸还原酶（BjNirK）活性低的原因，研究人员分析其结构与酶学特性。发现 BjNirK 在 pH 6.5 时活性与稳定性更高，结构存在独特底物入口及质子通道。揭示其低活性或源于结构设计，对共生关系具重要意义。
论文解读
在农业生物技术领域，根瘤菌（Rhizobia）作为重要的生物接种剂，与豆科植物如大豆的共生固氮作用对农业生产意义重大。然而，根瘤菌的反硝化作用会释放含氮气体，带来环境隐患。其中，日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）USDA110 是大豆生物接种剂的常用菌株，但其含铜亚硝酸还原酶（copper-containing nitrite reductase，NirK，简称 BjNirK）存在酶活性较低的现象，这一特性背后的分子机制及生物学意义尚不明确。深入探究 BjNirK 低活性的原因，不仅能揭示根瘤菌代谢调控的奥秘，也为优化其环境友好性提供理论依据。
为解决上述问题，来自阿根廷国家科学技术促进局（ANPCyT）、阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET）、阿根廷国立滨海大学（Universidad Nacional del Litoral）以及南非国家研究基金会（NRF）等机构的研究人员，针对 BjNirK 的结构与功能展开研究。相关成果发表在《Archives of Biochemistry and Biophysics》。
主要技术方法
研究采用了重组蛋白表达纯化技术，在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达 BjNirK 并进行纯化；运用坐滴蒸汽扩散法进行蛋白质结晶，获得适合 X 射线衍射分析的晶体；通过 X 射线衍射技术解析 BjNirK 的三维结构，分辨率达 1.30 ?；结合热位移分析（thermal shift assays）检测酶在不同 pH 条件下的稳定性；利用可见光谱、共振拉曼光谱（resonance Raman spectroscopies）及电子顺磁共振（EPR）监测的氧化还原滴定等手段分析酶的电子结构与电子转移过程；借助生物信息学方法研究酶与电子供体的相互作用。
研究结果
酶活性与 pH 相关性
无论使用生理电子供体还是人工电子供体，BjNirK 在 pH 6.5 时的活性均显著高于 pH 8.0 时。热位移分析显示，该酶在 pH 6.5 条件下稳定性更强，表明 pH 可通过影响酶构象稳定性调控活性。
结构特征解析
X 射线结构数据表明，与其他 I 类 NirK 结构相比，BjNirK 的底物入口通道（funnel for substrate entry）腔体更宽，除主质子通道和次级质子通道外，还存在额外的质子供应通道（additional channel for proton provision）。其 T2Cu 活性位点可容纳 1 或 2 个水分子，使金属位点分别呈四配位或五配位状态。固态和溶液状态下的光谱分析（可见光谱与共振拉曼光谱）均显示，T1Cu 位点具有强蓝色特征（strong blue character），与结构数据高度吻合。
电子转移与相互作用研究
EPR 监测的氧化还原滴定表明，在 pH 6.5 和 pH 8.0 条件下，催化速率均不受蛋白质内 T1Cu?T2Cu 电子转移反应限制。生物信息学研究显示，酶与电子供体的相互作用无 pH 依赖性。这两项结果表明，BjNirK 的低活性并非源于电子供体与酶的低效相互作用或电子转移障碍。
结论与讨论
本研究通过多学科手段揭示了 BjNirK 的结构与功能特性。结构上，其独特的底物入口通道和质子通道设计，以及 T2Cu 位点的配位灵活性，可能是导致酶活性较低的关键因素。功能分析表明，pH 对酶活性的调控主要通过影响稳定性而非电子转移或底物结合。结合生物信息学结果推测，根瘤菌中 BjNirK 的低活性可能是共生关系中的一种适应性策略，通过限制反硝化作用强度，在维持氮素供应的同时减少环境负担。
该研究不仅为根瘤菌代谢调控机制提供了新见解，也为设计环境友好型生物接种剂提供了结构基础。例如，可通过改造 NirK 结构优化根瘤菌的反硝化特性，在促进植物生长的同时降低生态风险。此外，研究中建立的多技术联用方法（结构解析与光谱分析结合）为其他金属酶的功能研究提供了参考范式。
