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该综述聚焦密码子扩展（Codon Expansion）这一合成生物学前沿技术，系统梳理了利用终止密码子、四联体密码子、有义密码子压缩三种策略将非天然氨基酸（ncAAs）掺入蛋白质的机制，探讨其优势、局限及挑战，并展望提升掺入效率与保真度的解决方案，为生物技术应用提供新视角。
遗传密码扩展的研究进展与非天然氨基酸掺入策略
引言
遗传密码传统上由 64 个密码子组成，编码约 20 种标准氨基酸及终止信号，其简并性虽保障了稳定性，但限制了生物体内蛋白质合成的氨基酸多样性。密码子扩展技术通过为非天然氨基酸（ncAAs）生成空白密码子，突破了这一限制。相较于化学合成，体内生产含 ncAAs 的蛋白质具有简化合成流程、降低成本及克服肽链长度限制等优势，有助于设计具有新型化学性质的蛋白质，在药物递送特异性提升、治疗性蛋白质稳定性增强等医药领域展现出潜力。
此外，密码子扩展研究对基础科学与生物技术产业发展具有推动作用。通用遗传密码允许遗传物质在物种、病毒及生物系统间转移，基于此的遗传密码改造可构建正交生物系统，阻止外源基因的正确翻译。同时，该研究为探索密码子选择规则、tRNA 性质及遗传信息的解码与翻译过程提供了新视角，有助于阐明遗传密码解码的基本原理，揭示不同生物体转录和翻译过程的复杂细节。
早期研究主要围绕琥珀终止密码子 UAG 展开，因其不编码氨基酸且在生物体中使用频率低。随着对空白密码子需求的增加，研究重点拓展至通过四联体密码子及有义密码子压缩获取更多空白密码子。同时，相互正交的 tRNA / 氨基酰 - tRNA 合成酶（aaRS）对的发现与改造，使得多个 ncAAs 在扩展密码子中的掺入成为可能。从细胞工程到全基因组重建，多种改进翻译机制的方法也被广泛应用。本综述将探讨密码子扩展及 ncAA 掺入技术的最新进展，并勾勒该快速发展领域的未来发展轨迹。
基于琥珀终止密码子的体内密码子扩展
密码子扩展研究与 tRNA 及 aaRS 的研究进展密切相关。该领域的初步研究聚焦于将氨基酸连接到与其天然对应物不同的 tRNA 上，这表明除标准氨基酸外，更多类型的生物单体可用于构建蛋白质。接下来的关键步骤是为 ncAAs 确定一个合适的密码子。由于天然遗传密码中 64 个密码子里仅有 3 个终止密码子（UAG、UAA、UGA）不编码氨基酸，早期研究选择琥珀终止密码子 UAG 作为空白密码子，因其在生物体中使用频率低，干扰较少。通过设计正交的 tRNA/aaRS 对，可将 ncAAs 特异性地引入 UAG 密码子位置，实现蛋白质中 ncAAs 的定点掺入。
基于四联体密码子的翻译系统
为获取更多空白密码子，研究人员将目光投向四联体密码子。理论上，由四碱基反密码子组成的四联体密码子系统可生成 200 多个额外的空白密码子。鉴于翻译过程中已报道存在占据四个碱基的移码抑制因子，研究致力于开发利用四联体密码子的翻译系统。四联体密码子的引入拓展了遗传密码的容量，为同时掺入多种 ncAAs 提供了可能。然而，四联体密码子的翻译效率及与传统三联体密码子翻译机制的兼容性仍需进一步优化，例如需解决核糖体在识别四联体密码子时的框架移位误差问题，以确保 ncAAs 准确掺入。
基于三联体有义密码子的密码子扩展
天然遗传密码中存在 61 种有义密码子，其中多个密码子编码同一氨基酸，理论上可将部分冗余的有义密码子重新分配为 ncAAs 的编码密码子。以大肠杆菌中罕见使用的 AGG 密码子为例，多项研究尝试将 ncAA 重新分配至该密码子。为减少干扰，需从必需基因中移除 AGG 密码子并替换为同义密码子，但即便在正交 tRNA 表达水平极高的情况下，蛋白质产量仍较低。这可能是由于内源 tRNA 对重新分配的有义密码子仍存在一定识别能力，导致 ncAA 掺入效率受限，同时也反映出有义密码子压缩策略在实际应用中面临的挑战，如如何平衡密码子重新分配与细胞正常蛋白质合成的需求。
多肽功能的工程化改造
ncAAs 的掺入使蛋白质能够引入新型化学功能。其中一个常见应用是利用天然蛋白酶降解含 ncAA 蛋白质的低效性，延长治疗性蛋白质的半衰期。例如，FDA 批准药物 Ozempic 和 Wegovy 的活性成分司美格鲁肽（semaglutide）含有氨基异丁酸，通过这种方式提高了药物在体内的稳定性。另一种方法是通过替换氨基酸残基赋予蛋白质特定的反应活性基团，用于蛋白质标记、交联或与其他分子特异性结合，为蛋白质功能研究及生物共轭技术提供了有力工具，推动了靶向药物开发及生物成像等领域的发展。
相互正交 tRNA/aaRS 对的开发
随着所需 aaRS/tRNA 对数量的增加，确保它们之间的相互正交性（即不同对之间不发生交叉反应）变得极具挑战性。最近开发的 tRNA 延伸（tREX）技术可直接评估 tRNA 的氨基酰化状态，此前该状态需通过测量 GFP 荧光等间接方法评估。该检测方法利用氨基酰化 tRNA 的 3' 端免受二醇氧化的特性，氧化处理后，5' 突出端引物和聚合酶可结合并延伸，通过后续的检测手段（如荧光定量）即可直接反映 tRNA 的氨基酰化程度，为高效筛选和优化正交 tRNA/aaRS 对提供了更直接、准确的方法，有助于加速多 ncAAs 同时掺入系统的构建。
结论
密码子扩展技术突破了天然遗传密码的限制，为生物体的重新设计提供了可能，为生物技术和生物工业领域提供了新工具与新见解。琥珀终止密码子作为空白密码子的应用为密码子扩展奠定了基础，在此基础上发展的四联体密码子系统及压缩有义密码子的重编码菌株进一步推动了密码子扩展的发展。遗传密码的扩展加深了我们对蛋白质结构与功能关系的理解，拓展了蛋白质工程的边界。尽管当前各策略仍存在效率、保真度及正交性等方面的挑战，但随着技术的不断进步，密码子扩展有望在未来实现更广泛的应用，如复杂功能蛋白质的大规模生产、新型生物传感器的开发及基因治疗载体的优化等，持续推动生命科学与健康医学领域的创新。
