CRISPR辅助纳米孔传感技术实现乙型肝炎表面抗原的超灵敏临床检测

为解决乙型肝炎病毒（HBV）感染早期诊断和治疗监测中HBsAg检测灵敏度不足的问题，研究人员开发了一种基于CRISPR-Cas12a系统与纳米孔传感技术联用的新方法。该技术通过竞争性结合和限制性酶切反应将HBsAg信号转化为ssDNA，利用Cas12a的trans切割活性（kcat/KM > 106 s?1 M?1）实现信号放大，最终通过纳米孔单分子检测达到10 fM的定量限（LOQ）。临床验证显示其性能优于传统检测技术，为HBV精准诊疗提供了新工具。

　　

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球公共卫生的重大挑战，每年导致近百万人死亡。尽管现有治疗手段可控制病情，但早期诊断和疗效监测仍面临瓶颈——传统HBsAg检测方法（如酶联免疫吸附试验）的灵敏度不足，难以识别低浓度HBsAg的隐匿性感染（occult HBV infection）。更棘手的是，作为HBV持续感染关键因子的共价闭合环状DNA（cccDNA）需通过肝活检获取，这种有创操作限制了临床普及。研究表明，血清HBsAg水平与肝内cccDNA含量呈正相关，因此开发超灵敏HBsAg检测技术成为破局关键。

四川大学华西医院的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表的研究中，创新性地将CRISPR-Cas12a系统的特异性识别能力与纳米孔单分子检测技术相结合，建立了HBsAg检测新平台。该技术通过三步级联放大策略：首先利用HBsAg与适配体的竞争性结合释放DNA探针；随后经PCR扩增和限制性内切酶（Nb.BbVCI）消化产生激活Cas12a的ssDNA；最后借助Cas12a的trans切割活性（非特异性ssDNA降解）产生大量短链DNA，通过生物纳米孔（α-溶血素）实现电信号定量，灵敏度较传统方法提升3个数量级。

CRISPR辅助纳米孔检测策略
研究团队设计了一种"适配体-抗原竞争-酶切激活"的级联反应：当样本中存在HBsAg时，其与适配体结合会释放预封闭的DNA触发链，经PCR扩增后产生双链DNA产物；Nb.BbVCI酶切将双链DNA转化为激活Cas12a的ssDNA，激活后的Cas12a大量切割报告分子（荧光标记ssDNA），产生的短链DNA在纳米孔中产生特征性电流信号。该设计巧妙地将大分子蛋白检测转化为核酸信号放大问题。

临床样本验证
在102例临床样本（含健康对照、慢性HBV患者和隐匿性感染病例）测试中，该方法检测下限达0.01 pg/mL，定量限（LOQ）为10 fM，显著优于化学发光法（LOQ=1 pM）。尤其对5例常规检测阴性的隐匿性感染样本均实现准确检出，证实其临床适用性。纳米孔检测的变异系数（CV）<5%，显示优异的重现性。

结论与展望
这项研究通过多学科技术融合，首次实现CRISPR系统与纳米孔技术联合检测蛋白质标志物。其创新性体现在：1）利用竞争性结合策略突破CRISPR仅能检测核酸的限制；2）通过PCR-CRISPR-纳米孔三级放大将灵敏度提升至单分子水平；3）生物纳米孔相比固态纳米孔具有更好稳定性。该技术不仅为HBV早期诊断提供新工具，其模块化设计思路（适配体替换）更可拓展至其他疾病标志物检测。研究者特别指出，未来通过微流控芯片整合有望实现床旁检测（POCT），推动精准医疗发展。