基于质谱法重新评估人体细胞中腺苷核苷多磷酸水平的研究

为探究二核苷多磷酸（NpnNs）在细胞代谢中的作用，研究人员利用质谱法结合13C 同位素标记内标，对 HEK293T 和 H1299 细胞中 Ap3/4N 水平进行定量。发现 Fhit 缺失细胞中 Ap3N 和 Ap4N 显著升高，揭示水解酶活性变化可能是应激主要响应机制。

　　

在细胞代谢的复杂网络中，一类被称为二核苷多磷酸（dinucleoside polyphosphates，Np_nNs，N 代表腺苷、鸟苷、胞苷或尿苷，n 为磷酸基团数量）的小分子宛如神秘的 “信使”，虽在 20 世纪 70 年代就引起科学家关注，却长期笼罩在功能未知的迷雾中。这类分子在氧化应激、热激等压力条件下会大量积累，因此被视作 “警报素”（alarmones），但它们是否是细胞应激反应的核心角色，或是仅作为代谢副产物存在，始终是悬而未决的科学谜题。更关键的是，由于缺乏精准的定量分析手段，学界对其在不同细胞状态下的浓度变化规律知之甚少，尤其是在人类细胞中的内源性水平研究几乎空白。破解这些谜团，不仅能填补细胞代谢调控机制的重要拼图，更可能为揭示疾病发生发展的新机制打开一扇窗。

为驱散这些科学迷雾，来自相关研究机构的科研团队开展了一项极具创新性的研究。该团队聚焦于腺苷相关的二核苷多磷酸（Ap_3/4N，即含有 3 或 4 个磷酸基团的腺苷二核苷多磷酸），试图通过高灵敏度的分析手段，精准描绘其在人类细胞中的 “动态画像”，并探究关键酶类对其代谢的调控作用。研究成果发表在《Carbohydrate Research》，为该领域的发展提供了重要的方法学和机制学突破。

研究人员采用的核心技术方法包括：

1. 同位素标记内标合成技术：开发了一种不对称合成策略，以¹³C₅- 腺苷为起始原料，通过磷酸化、预活化和偶联三步骤，成功制备了 8 种¹³C 同位素标记的 Ap_3/4N 内标（包括¹³C-Ap_nN，n=3,4；N=A、C、G、U），合成产率在 6%-16% 之间，为后续定量分析提供了关键工具。
2. 三重四极杆质谱技术（TQ-MS）：对 HEK293T（正常细胞）和 H1299（FHIT 阴性细胞，FHIT 为脆性组氨酸三联体蛋白，Np₃N 水解酶）两种人类细胞系的胞内 Ap_3/4N 水平进行定量检测，并通过添加甲萘醌（menadione）诱导氧化应激，观察不同处理下的浓度变化。

结果与讨论

应激条件下 Ap_3/4N 水平的普遍升高

通过质谱分析发现，在氧化应激处理后，两种细胞系中的所有 Ap_3/4N 水平均呈现显著上升趋势，这与既往研究结果一致，进一步验证了 Ap_3/4N 作为应激响应分子的角色。这提示，无论细胞是否具备完整的 FHIT 功能，应激信号均能触发 Ap_3/4N 的生物合成增加，或抑制其降解过程。

FHIT 缺失对 Ap_3/4N 代谢的显著影响

在未施加应激的基础状态下，H1299 细胞（FHIT 阴性）中的 Ap₃N 水平较 HEK293T 细胞（FHIT 阳性）高出近 100 倍，Ap₄N 水平也提升约 10 倍。这一结果与此前文献报道的 “FHIT 表达不影响 Ap₄N 水平” 相矛盾，揭示 FHIT 作为 Np₃N 水解酶，不仅对 Ap₃N 具有强效降解作用，对 Ap₄N 的代谢同样至关重要。研究人员推测，FHIT 可能通过特异性识别磷酸基团数目，对不同链长的二核苷多磷酸发挥广谱水解功能。

应激响应机制的重新审视

值得注意的是，当对 FHIT 阴性的 H1299 细胞施加氧化应激时，其 Ap_3/4N 水平并未出现显著升高，而 FHIT 阳性的 HEK293T 细胞则表现出典型的应激诱导增长。这一差异表明，在 FHIT 缺失的细胞中，水解酶活性的丧失可能已导致 Ap_3/4N 处于代谢失衡的 “高位平台”，使得应激诱导的合成增加难以进一步体现。由此推断，细胞在面对外界压力时，首要的响应可能是调节水解酶活性（如 FHIT），而非立即增强生物合成通路，这为理解应激代谢重编程提供了新视角。

总结与意义

本研究通过开发新型同位素标记内标和质谱定量方法，首次系统性揭示了人类细胞中 Ap_3/4N 的代谢规律，修正了关于 FHIT 酶功能的传统认知。研究结果表明，FHIT 作为关键的 Np₃N 水解酶，对维持 Ap_3/4N 的稳态平衡起决定性作用，其缺失可导致相关分子异常积累，这可能与 FHIT 缺陷相关疾病（如肺癌、卵巢癌等）的代谢紊乱机制密切相关。此外，研究还提出 “水解酶活性变化优先于生物合成” 的应激响应假说，为探索细胞代谢调控网络提供了重要线索。未来，针对 FHIT 通路的干预策略或可成为调节细胞应激反应、干预代谢相关疾病的新方向，而本研究建立的质谱分析方法也将为同类分子的跨物种、跨组织研究提供标准化工具。