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为探究丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Psa）低温（<20℃）高致病性的分子机制，研究人员聚焦温度响应调控因子。发现 RS16350（TrpR2）通过与 HrpL 互作增强其与 hrp-box 结合，上调 III 型分泌系统（T3SS）基因，为病害防控提供新靶点。
猕猴桃作为广受喜爱的水果，其产业发展却长期受到溃疡病的严重威胁。这种由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引发的病害，在低温环境下（<20℃）发病率显著升高，给全球猕猴桃种植区带来巨大经济损失。然而，Psa 为何在低温下更具致病性？其背后的分子机制一直是困扰学界的难题。解开这一谜团，对于开发针对性的病害防控策略至关重要。
为了攻克这一科学问题，研究人员围绕 Psa 的温度依赖性致病机制展开深入研究。通过一系列实验，他们发现了一个关键的温度响应调控因子 ——TrpR2，为揭示 Psa 低温致病的奥秘提供了重要线索。相关研究成果发表在《Computational and Structural Biotechnology Journal》上。
研究人员主要采用了转录组分析、基因敲除与互补实验、细菌双杂交、微尺度热泳（MST）等技术方法。通过转录组分析比较 Psa 在 16℃和 28℃下的基因表达差异，筛选出与低温致病相关的关键基因；利用基因敲除技术构建热激蛋白（HSP）缺失突变体，通过致病性测定和 T3SS 基因表达分析，确定 RS16350（TrpR2）的功能；借助细菌双杂交和 MST 技术验证 TrpR2 与 HrpL 的相互作用及结合亲和力。
2.1 低温条件下 Psa 调控子的鉴定
转录组分析显示，与 28℃相比，Psa 在 16℃下有 708 个基因下调、741 个基因上调。GO 富集分析表明，上调基因主要与 III 型分泌系统（T3SS）功能、生物合成及代谢途径相关，包括 hopY1、hopAK1、hrpZ1、hrpK1 等 T3SS 基因，qRT-PCR 验证了这些基因在低温下的高表达。同时，12 个 HSP 基因在低温下显著下调，提示 HSP 可能作为温度传感器参与调控。
2.2 TrpR2 对 Psa 低温致病性的正向调控作用
通过构建 10 个 HSP 缺失突变体，发现 ΔRS16350 突变体在 16℃下的致病力显著下降，而其生长不受温度影响，表明 RS16350（TrpR2）特异性调控低温致病力。互补实验显示，回补 TrpR2 可恢复突变体的致病表型，进一步确认其功能。
2.3 TrpR2 增强低温下 T3SS 基因表达
以 hopY1-lux 为报告基因，发现 ΔtrpR2 突变体的荧光强度显著低于野生型和互补株，表明 TrpR2 正调控 T3SS 基因表达。对 hopAK1、hrpK1、hrpZ1 等基因的分析显示，其表达在低温下依赖 TrpR2 激活，证实 TrpR2 通过调控 T3SS 影响致病性。
2.4 TrpR2 功能保守氨基酸的鉴定
生物信息学分析表明，TrpR2 含有保守的 HSP 结构域，在假单胞菌属中高度保守。通过丙氨酸替代突变，确定 Asp18、Pro37 等 9 个保守氨基酸对 TrpR2 功能至关重要，这些突变体均无法恢复致病力和 T3SS 基因表达。
2.5 TrpR2 与 T3SS 调控因子 HrpL 结合增强基因表达
细菌双杂交和 MST 实验证实，TrpR2 与 HrpL（调控 T3SS 的 σ 因子）直接结合（Kd=2.41 μM），而与 HrpR、HrpS 无相互作用。分子对接和点突变实验确定，TrpR2 的 Ser14 和 HrpL 的 Asn150 是关键互作位点，TrpR2 通过增强 HrpL 与 hrp-box 启动子的结合亲和力（Kd从 6.41 μM 降至 3.70 μM），促进 T3SS 基因转录。
2.6 TrpR2 调控 T3SS 的分子机制
在大肠杆菌中的转录报告实验显示，共表达 TrpR2 和 HrpL 可使 hopY1-lux 表达提高约 5 倍，证实 TrpR2-HrpL 复合物通过增强 HrpL 与 hrp-box 的结合，激活下游 T3SS 基因转录，从而增强 Psa 的低温致病力。
讨论与结论
本研究首次揭示了 Psa 利用热激蛋白 TrpR2 作为温度响应调控因子的机制：在 16℃时，TrpR2 与 HrpL 结合形成复合物，增强 HrpL 对 hrp-box 启动子的结合，激活 T3SS 基因表达，进而提升病原菌的致病力；而在 28℃时，该调控轴功能减弱，形成温度依赖的致病开关。这一发现不仅填补了 Psa 低温致病分子机制的空白，也为开发靶向 TrpR2 的猕猴桃溃疡病防控策略提供了新方向，如设计干扰 TrpR2-HrpL 互作的小分子抑制剂，或通过基因编辑技术抑制 TrpR2 表达，为全球猕猴桃产业应对这一重大病害挑战提供了创新思路和理论依据。
