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塑料废弃物危机下，研究人员针对尼龙单体 HD 和 ACA 的环境风险，利用 CRISPR 辅助定向进化（CDE）改造恶臭假单胞菌 KT2440，筛选出 KgtP 转运蛋白、AlaC 转氨酶和 FrmA 脱氢酶构成的 KAF 通路，实现 HD 高效代谢，为混合塑料生物循环奠定基础。
塑料垃圾正以惊人的速度侵蚀着地球的生态环境，每年数百万吨的塑料被生产出来，其中相当一部分最终成为难以处理的废弃物。尼龙作为一种广泛应用于纺织、汽车和包装领域的聚酰胺，其生命周期后的降解会释放 1,6 - 己二胺（HD）和 6 - 氨基己酸（ACA）等单体，这些物质不仅在生态系统中持久存在，还带来了毒性和生物累积的风险。传统的塑料处理方式，如焚烧和填埋，不仅效率低下，还会引发二次污染，开发更可持续的塑料回收技术迫在眉睫。
在这样的背景下，为了应对尼龙废弃物带来的环境挑战，研究人员开展了一系列研究。虽然文中未明确提及具体研究机构，但研究人员利用 CRISPR 辅助定向进化（CDE）技术，对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 进行改造，旨在使其能够高效利用 HD 作为唯一氮源，并将其降解与细菌生长耦合。通过基因组和转录组分析，研究人员确定了参与 HD 降解的关键酶，最终发现了 KAF 通路（包含 KgtP 转运蛋白、AlaC 转氨酶和 FrmA 脱氢酶），该研究成果发表在《Environmental Technology 》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是利用 CRISPR 干扰（CRISPRi）和专家指导筛选来识别关键酶；二是通过全基因组重测序和生物信息学分析，比较野生型和进化菌株的基因组差异；三是运用 RNA-seq 和转录组数据处理，分析基因表达变化，挖掘 HD 代谢相关基因；四是进行合成遗传元件设计，优化通路表达并在不同菌株中验证。
3.1 恶臭假单胞菌在 M9HD 中的定向进化
研究人员构建了包含约 10?个 sgRNA 靶点的 CRISPR 库，转入恶臭假单胞菌 KT2440 后进行批次培养和恒化器连续培养。通过逐步增加选择压力，筛选出进化菌株 EG1 和 EG2。与野生型相比，EG2 在 M9HD 培养基中的最大比生长速率（μmax）显著提高，表明其对 HD 的利用能力增强。CRISPR 辅助定向进化技术相比传统方法，能更全面地引入基因组变异，加速菌株适应性进化。
3.2 全基因组测序揭示 EG2 的基因组适应
对野生型和 EG2 进行全基因组测序发现，EG2 基因组发生了约 26.7 kb 的大片段缺失，涉及生物膜形成相关的fapABC基因和氮代谢调控的rpoN基因等。此外，还存在 408 个单核苷酸多态性（SNPs）及插入 / 缺失突变。这些基因组变化可能通过解除代谢抑制或激活补偿通路，促进菌株对 HD 的代谢和适应。
3.3 转录组分析突出与 HD 降解相关的基因
转录组分析显示，EG2 与野生型相比有 346 个差异表达基因（DEGs），主要富集在 ABC 转运蛋白、鞭毛组装、精氨酸生物合成等通路。其中，17 个上调基因多与化合物降解相关，如 PP4_RS12845、PP4_RS12850 等，提示它们在 HD 代谢中可能发挥关键作用。大量下调基因则反映了菌株在氮限制条件下的应激反应，通过抑制非必需基因来节约资源。
3.4 HD 生物转化代谢通路的发现与验证
利用 CRISPRi 技术对上调基因进行功能验证，发现抑制benA、tauD和frmA等基因会显著影响菌株在 M9HD 中的生长，确认了它们在 HD 代谢中的重要性。结合已知生化反应，提出了 HD 转化为己二酸（AA）的 KAF 通路，该通路通过 AlaC 转氨酶和 FrmA 脱氢酶的催化作用，将 HD 逐步转化为中间产物，最终生成 AA。在恶臭假单胞菌和大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达该通路组件，证实了其功能有效性，其中 KgtP 转运蛋白对 HD 的摄取至关重要。
研究结论与讨论
本研究通过 CRISPR 辅助定向进化技术，成功改造恶臭假单胞菌 KT2440，使其能够高效利用尼龙单体 HD 作为氮源，并揭示了 KAF 通路在 HD 降解中的关键作用。该研究不仅为尼龙废弃物的生物循环提供了新的思路和技术手段，也为构建能够降解混合塑料单体的合成细菌群落奠定了基础。未来，结合合成生物学工具，有望实现复杂塑料聚合物的高效降解和价值化利用，推动循环经济在塑料废弃物管理中的应用，为环境保护和可持续发展做出重要贡献。研究中开发的菌株改造和代谢通路解析方法，也为其他塑料污染物的微生物降解研究提供了有益的借鉴。
