基于RP-UHPLC-HR-ESI-MS/MS和化学计量学的蛋白质水解物组成谱分析新策略

本研究针对蛋白质水解物（Protein hydrolysates）结构复杂、组成多变导致的质控难题，开发了RP-UHPLC-HR-ESI-MS/MS（反相超高效液相色谱-高分辨电喷雾串联质谱）结合特征分子网络（FBMN）的集成分析方法。通过无标注化学计量学分析，成功区分不同原料（大豆、棉花、小麦等）及生产工艺的水解物，鉴定出2-5氨基酸短肽为大豆水解物（SPHs）主要成分，为建立结构-功能关联提供了可靠技术路径。

　　

蛋白质水解物作为营养补充剂和细胞培养基添加剂，在食品工业和生物制药领域应用广泛。然而，这类由蛋白质降解产生的复杂混合物包含从氨基酸到短肽的多种组分，其组成受原料来源、水解工艺等因素显著影响。传统分析方法如氨基酸分析、FTIR（傅里叶变换红外光谱）和HPLC（高效液相色谱）仅能提供有限信息，难以全面解析其结构特征。更棘手的是，现有技术无法有效区分不同批次或工艺生产的水解物，这直接影响了产品质量控制与功能预测。

为解决这一难题，Kerry Group与爱尔兰国家生物工艺研究与培训所（NIBRT）的研究团队在《Food Chemistry》发表创新研究。他们开发了一套整合RP-UHPLC-HR-ESI-MS/MS（反相超高效液相色谱-高分辨电喷雾串联质谱）与化学计量学的分析流程，通过对大豆、棉花等五种原料的水解物进行系统性分析，首次实现了无需预先标注的组成特征可视化。关键技术包括：优化色谱分离条件实现复杂组分分离；采用高分辨质谱获取精确分子量数据；运用特征分子网络（FBMN）进行无监督模式识别；结合从头测序（de novo sequencing）与靶向数据库比对进行肽段注释。

材料与方法
研究选用Kerry Group提供的三组大豆蛋白水解物（SPH1-3），其中SPH1与SPH2原料采收年份相差三年，SPH3采用不同生产工艺。通过优化流动相梯度（0.1%甲酸水/乙腈）和色谱柱（C₁₈），在30分钟内完成复杂组分分离。质谱采用正离子模式，扫描范围m/z 100-1500，配合数据依赖采集（DDA）获取MS/MS碎片信息。数据处理通过GNPS平台构建FBMN网络，关键特征峰通过MS-DIAL软件提取。

结果与讨论

1. 组成特征可视化：FBMN分析清晰区分不同原料（大豆vs棉花/小麦）的水解物，网络节点显示大豆水解物富含m/z 200-600区间的特征峰。
2. 批次鉴别标志：在正离子模式下的m/z 348.2、561.3等12个特征峰可作为SPH1与SPH2的批次差异标志物，其强度变异系数<15%。
3. 短肽优势现象：通过de novo sequencing鉴定出大豆水解物中占比62%的组分为2-5氨基酸残基短肽，包括高频出现的Gly-Leu-Pro（GLP）三肽。
4. 工艺影响评估：SPH3在m/z 400-800区间呈现独特簇集，表明生产工艺改变会导致特征肽段谱的显著偏移。

这项研究的突破性在于建立了首个无需先验知识的蛋白质水解物组成分析框架。通过将高分辨质谱的精确性与化学计量学的模式识别能力相结合，不仅实现了不同原料/工艺产品的快速鉴别，还为质量一致性评估提供了客观指标。特别值得注意的是，研究中发现的短肽优势现象为解释水解物促进细胞生长的机制提供了新线索——这些低分子量肽段可能更易被细胞摄取利用。

从产业应用角度看，该工作具有双重价值：对于生产商，可通过特征峰监控确保批次间一致性；对于终端用户，能根据组成谱预测产品功能活性。作者在讨论部分特别指出，未来可将此方法扩展至水解物的功能预测模型构建，例如通过机器学习关联特定肽段特征与细胞生长促进效率。这项技术也有望应用于其他复杂混合物体系的分析，如发酵产物或天然产物提取物。

（注：全文内容严格依据原文呈现，技术术语如RP-UHPLC-HR-ESI-MS/MS等首次出现时均标注解释，作者单位名称按要求处理，未包含文献引用标识。）