乳清蛋白双功能水解物的酶筛选：基于虚拟酶解、片段组学和分子对接的计算机模拟研究

为解决 WPH 特定功能优势未被证实的问题，研究人员结合虚拟酶解、片段组学和分子对接，筛选兼具抗炎抗氧化功能的 WPH 复合蛋白酶组合。发现 KP 组合效果更佳，为功能性婴幼儿配方奶粉开发奠定理论基础。

　　

生命早期的氧化应激与炎症反应如同潜伏在新生儿体内的 “隐形杀手”。当小生命降临世间，子宫内外氧分压的剧烈波动、环境刺激等因素，会打破机体氧化与抗氧化的微妙平衡，导致活性氧（ROS）过度生成，进而引发新生儿氧化应激和炎症性疾病。尽管乳清蛋白因其高消化性和丰富生物活性成分，被广泛应用于婴幼儿配方奶粉以模拟母乳中的乳清蛋白 - 酪蛋白比例，但市售乳清蛋白水解物（WPH）的特定功能优势一直缺乏科学验证，尤其是同时具备抗炎和抗氧化双重功效的 WPH 开发仍处于空白状态。

为填补这一研究空白，国内研究团队围绕 “如何精准筛选出能赋予 WPH 双重功能的蛋白酶组合” 这一核心问题展开攻关。研究成果发表在《Food Research International》，为功能性婴幼儿配方奶粉的创新提供了关键突破。

研究人员采用多技术融合的策略开展研究。首先通过虚拟酶解技术，从多种蛋白酶中初筛出糜蛋白酶 A、蛋白酶 K、木瓜蛋白酶等 5 种单体酶，再基于多肽组成、潜在活性频率等指标，锁定 “糜蛋白酶 A + 木瓜蛋白酶（AP）” 和 “蛋白酶 K + 木瓜蛋白酶（KP）” 两组复合酶组合。随后借助片段组学分析酶解片段的物理化学性质，并利用分子对接技术解析酶解产物与炎症、氧化相关信号通路靶点的相互作用机制，最后通过体外实验验证酶解产物的水解度、抗炎抗氧化活性等关键指标。

活性分析与片段组学验证

在乳清蛋白单体酶解片段（WPSF）分析中，不同蛋白酶因切割位点差异产生了具有独特氨基酸序列的多肽。通过对比 WPSF 的组成，研究团队发现蛋白酶 K 与木瓜蛋白酶的分步酶解组合展现出显著优势。片段组学数据显示，KP 组的乳清蛋白复合酶解片段（KP_WPCF）中二肽比例高达 60.65%（对比 AP 组的 49.35%），疏水氨基酸占比 32%（AP 组 19.6%），且绝对净电荷 > 0 的肽段比例达 61.36%（AP 组 56.31%）。这些特征预示 KP_WPCF不仅具有更强的自由基清除能力，还具备更优的消化吸收潜力且无毒性风险。

分子对接揭示作用机制

分子对接实验进一步揭示了 KP_WPCF的功能靶点与作用通路。研究发现，其酶解产物可通过与 NF-κB 信号通路中的 P65、IKK-β、iNOS 蛋白，以及 Keap1-Nrf2 信号通路中的 Keap1 蛋白发生特异性结合，从而发挥抗炎和抗氧化效应。这种多靶点调控机制为解释 WPH 的双重功能提供了分子层面的直接证据。

体外实验验证功能活性

体外功能验证结果表明，KP 组合酶解产生的乳清蛋白水解物（K-P_WPH）表现出优异的综合性能：水解度（DH）达 24.76%，一氧化氮（NO）抑制率为 14.85%，氧自由基吸收能力（ORAC）达 9.97±0.41 mmol Trolox/g，且超过 90% 的肽段分子量小于 3 kDa。这些数据直观证实了 KP 组合在制备高活性 WPH 中的显著优势。

研究结论与意义

本研究通过 “虚拟筛选 - 机制解析 - 实验验证” 的跨学科研究模式，首次系统证明了蛋白酶 K 与木瓜蛋白酶（KP）的分步酶解组合可定向制备兼具抗炎与抗氧化功能的 WPH。研究不仅突破了传统蛋白酶筛选依赖试错法的局限，建立了基于生物信息学的功能导向型酶筛选体系，还为婴幼儿配方奶粉的功能化升级提供了关键技术路径 —— 通过精准调控蛋白酶组合，可定制化生产针对新生儿氧化应激与炎症防护的功能型乳清蛋白原料。

这一成果在生命科学与营养健康领域具有双重价值：一方面，为食品蛋白资源的高值化利用开辟了 “计算驱动 - 功能导向” 的新范式；另一方面，其构建的多指标评价体系和分子机制解析方法，可为其他功能性肽类的靶向开发提供普适性方法论参考，推动营养科学从 “经验型配方” 向 “精准设计” 时代迈进。