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为探究 Diplodia sapinea（D. sapinea）中的真菌病毒，研究人员对芬兰分离株开展全 RNA 测序，发现新型 RNA 病毒 DsFLV1。其基因组为 7,494 nt 的正义单链 RNA，含保守结构域，属 Deltaflexiviridae 科。该研究首次报道感染 D. sapinea 的 +ssRNA 病毒，具重要科学意义。
在广袤的微生物世界里，真菌病毒（mycovirus）如同隐藏的 “微生物操纵者”，默默影响着真菌的生命进程。 Diplodia sapinea 作为一种广泛分布的针叶树病原菌，能在内生、致病和腐生阶段灵活切换生活方式，给林业生产带来巨大威胁。然而，尽管此前已在该真菌中发现两种全病毒（totivirus），但关于其正义单链 RNA（+ssRNA）病毒的感染情况却一直空白。真菌病毒研究不仅有助于揭示病原真菌与病毒的互作机制，更为开发新型生物防治策略提供了潜在方向 —— 例如，利用具有减毒作用的真菌病毒控制病原菌的致病性，这在板栗疫病的生物防治中已有成功先例（如 Cryphonectria hypovirus 1）。因此，深入挖掘 D. sapinea 中的新型病毒，成为破解其致病机制与防控难题的关键一环。
来自芬兰自然资源研究所（Natural Resources Institute Finland, Luke）的研究人员 Suvi Sutela 及其团队，针对这一科学空白展开研究。他们从芬兰南部苏格兰松幼苗的感病枝条中分离出 D. sapinea 菌株 138，通过全 RNA 测序（total RNA sequencing）和 Sanger 测序技术，首次发现并鉴定了一种新型真菌病毒，命名为 “Diplodia sapinea 柔韧性类似病毒 1”（Diplodia sapinea flexi-like virus 1, DsFLV1）。该研究成果发表在国际期刊《Archives of Virology》上，为真菌病毒研究领域添上了重要一笔。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过表面灭菌枝条获取纯真菌培养物，提取 DNA 并利用种特异性引物（DiSapi-F 和 Diplo-R）结合 Sanger 测序对菌株进行物种鉴定；其次，从培养的菌丝中提取总 RNA，经 DNase I 处理后进行全 RNA 测序，结合 Trinity 软件进行从头组装（de novo assembly），获得病毒样重叠群（contigs）；随后，利用 T4 接头连接和病毒特异性引物，通过 PCR 扩增病毒基因组的 5' 和 3' 非翻译区（UTR），并通过 Sanger 测序验证全基因组序列；最后，运用生物信息学工具进行开放阅读框（ORF）预测、保守结构域分析及系统发育树构建。
病毒基因组结构与功能预测
通过全基因组测序分析发现，DsFLV1 基因组为 7,494 核苷酸（nt）的正义单链 RNA（不含 poly (A) 尾），包含 5 个开放阅读框（ORF）。其中，最大的 ORF1（6,078 nt）编码一个含 2,025 个氨基酸的复制相关多聚蛋白（replication-associated polyprotein, RP），该蛋白包含病毒甲基转移酶（Mtr）、病毒解旋酶（Hel）和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRP）等保守结构域，这些结构域是 tymovirales 目病毒的典型特征，暗示 DsFLV1 可能具有与该目病毒相似的复制机制。ORF2 编码一个潜在的衣壳蛋白（capsid protein, CP），其氨基酸序列与大豆叶相关真菌柔韧性病毒 1（soybean leaf-associated mycoflexivirus 1）和核盘菌 Deltaflexivirus 1（Sclerotinia sclerotiorum deltaflexivirus 1）的衣壳蛋白具有一定相似性，结合其他 Deltaflexiviridae 科病毒具二十面体核衣壳的特性，推测 ORF2 产物可能负责病毒颗粒的组装。而 ORF3-5 则通过替代起始密码子（CUG）启动翻译，编码功能未知的短肽，其生物学作用尚待进一步研究。
系统发育分析与分类地位
基于复制相关多聚蛋白氨基酸序列的最大似然法（ML）系统发育分析显示，DsFLV1 与 Deltaflexiviridae 科病毒聚为独立分支，其中与白粉菌相关柔韧性病毒 2（Erysiphe necator-associated flexivirus 2, EnaFV2）的亲缘关系最为接近（氨基酸序列一致性 60.76%）。尽管目前 Deltaflexiviridae 科仅包含 Deltaflexivirus 一个属（4 个种），但 DsFLV1 的发现表明，该科可能需要进一步扩展分类单元。值得注意的是，除一株病毒外，该科成员均具有 5'-m7G 帽和 3'-poly (A) 尾结构的 +ssRNA 基因组，且此前被认为无衣壳结构，而 DsFLV1 潜在衣壳蛋白的发现，为该科病毒的结构研究提供了新视角，可能推动对 “无衣壳病毒” 传统认知的更新。
研究结论与意义
本研究首次报道了感染 D. sapinea 的正义单链 RNA 病毒 ——DsFLV1，填补了该病原菌在 +ssRNA 病毒研究领域的空白。通过基因组特征与系统发育分析，确认其属于 Deltaflexiviridae 科的新成员，为真菌病毒的分类学研究提供了重要样本。此外，DsFLV1 潜在衣壳蛋白的预测，挑战了 Deltaflexiviridae 科病毒 “无衣壳” 的传统观点，为深入研究该科病毒的组装机制与传播途径奠定了基础。从应用层面看，真菌病毒的减毒特性可能为 D. sapinea 所致病害的生物防治提供新策略，例如通过筛选具有致病性抑制作用的病毒株系，开发环境友好型生物制剂，这对于针叶林健康维护与全球林业可持续发展具有重要意义。
该研究不仅拓展了真菌病毒的多样性认知，更通过多技术整合的研究模式，为同类病原真菌的病毒挖掘提供了方法论参考。未来研究可进一步聚焦 DsFLV1 与宿主的互作机制，探索其在真菌致病性调控中的具体作用，为开发靶向病毒的病害防控技术开辟新路径。
