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多巴胺（DA）在医药、材料等领域应用广泛，但大肠杆菌体内合成研究有限。研究人员借助知识驱动设计 - 构建 - 测试 - 学习（DBTL）循环，结合体外粗细胞裂解液分析与高通量核糖体结合位点（RBS）工程，优化多巴胺生产菌株，使产量提升 2.6-6.6 倍，为代谢工程提供新策略。
在生物医药与化工领域，多巴胺（3,4 - 二羟基苯乙胺）是一种极具潜力的有机化合物，不仅在急救医学中用于调节血压和肾功能，在癌症诊疗、废水处理及燃料电池锂阳极生产等领域也展现出重要应用价值。然而，当前多巴胺的大规模生产主要依赖化学合成或酶系统，这些方法存在环境不友好和资源消耗大的缺点。尽管利用大肠杆菌进行体内合成的方法已被探索，但相关研究有限，且报道的最高产量仅为 27 mg/L 和 5.17 mg/g
biomass，亟需通过高效的代谢工程策略提升生产效能。
为突破现有生产瓶颈，德国斯图加特大学（University of Stuttgart）的研究人员开展了以知识驱动设计 - 构建 - 测试 - 学习（DBTL）循环为核心的多巴胺生产优化研究。该研究通过整合体外机制解析与体内通路优化，成功开发出高效的多巴胺生产菌株，相关成果发表在《Microbial Cell Factories》。
研究采用的关键技术方法包括：一是利用粗细胞裂解液（Crude Cell Lysates）系统进行体外酶活性分析，通过混合不同比例的 HpaBC（4 - 羟苯基乙酸 3 - 单加氧酶）和 Ddc（L - 多巴脱羧酶）裂解液，筛选最佳酶比例；二是运用高通量核糖体结合位点（RBS）工程，通过优化 Shine-Dalgarno（SD）序列的 GC 含量，精细调控基因表达水平；三是借助微生物反应器（Microbioreactor）进行高通量培养与代谢分析，实现菌株性能的快速评估。
宿主菌株工程与酪氨酸供应优化
研究以大肠杆菌 FUS4 为亲本菌株，通过敲除转录调控因子 TyrR 并过表达突变型 tyrA（Y263C），解除酪氨酸合成的反馈抑制。结果表明，双突变菌株 FUS4.T2 的酪氨酸产量达 0.83±0.01 g/L，较单突变株 FUS4.T1 提升 38%，为后续多巴胺合成提供了充足前体。
知识驱动 DBTL 循环的机制解析
体外粗细胞裂解液实验显示，当 HpaBC 与 Ddc 的比例从 1:1 提升至 100:1 时，多巴胺产量显著增加 98%，表明 HpaBC 活性是限速步骤。通过将体外优化的酶比例转化为体内 RBS 设计参数，结合高通量筛选，发现高 GC 含量的 HpaBC RBS（80-100%）与低 GC 含量的 Ddc RBS 组合可最大化多巴胺产量。
RBS 工程与生产效能提升
通过设计 56 种 RBS 组合（成功构建 51 种，成功率 91.1%），筛选出最优菌株 A.10，其多巴胺产量达 69.03±1.2 mg/L（34.34±0.59 mg/gbiomass），较现有报道分别提升 2.6 倍和 6.6 倍。蛋白质组学分析证实，HpaBC 的高 GC RBS 增强其表达，而 Ddc 的低 GC RBS 促进翻译效率，二者协同平衡了代谢通量。
研究结论表明，知识驱动 DBTL 循环通过整合体外机制研究与体内高通量优化，显著提升了多巴胺生产效率。该策略不仅揭示了 Shine-Dalgarno 序列 GC 含量对 RBS 强度的关键影响，还为多酶通路的动态平衡提供了普适性优化模型。未来结合机器学习与自动化生物铸造厂（Biofoundry）技术，有望进一步推动微生物细胞工厂在复杂化合物合成中的应用，为可持续生物制造提供新范式。
