编辑推荐：
推荐
为探究 DLK1 在肺纤维化中对 AT2 细胞的作用，研究人员利用 IPF 患者样本、博来霉素（BLM）诱导小鼠模型及细胞模型，发现 DLK1 在 AT2 细胞高表达，抑制 DLK1 可通过 TTF-1/CLDN6 通路促进 AT2 分化、缓解纤维化，为 IPF 治疗提供新靶点。
论文解读
研究背景
肺部作为人体与外界气体交换的核心器官，其健康至关重要。特发性肺纤维化（IPF）却如同潜伏在肺部的 “沉默杀手”，这是一种致命的年龄相关性间质性肺病，病因不明，患者从确诊起中位生存期仅 2-4 年。IPF 的起始与反复的上皮损伤密切相关，这会破坏上皮屏障的完整性，增加血管通透性，最终导致肺部纤维化。肺泡上皮细胞（AECs）在其中扮演着关键角色，异常激活的 AECs 是 IPF 发展的重要启动因素，它们与免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞相互作用，促使成纤维细胞和肌成纤维细胞活化，形成促纤维化表型。
AECs 由肺泡 Ⅰ 型（AT1）和 Ⅱ 型（AT2）细胞组成。AT1 细胞约占肺泡表面积的 95%，主要负责氧气交换；AT2 细胞则是兼性干细胞，在肺部损伤时能够更新并分化为 AT1 细胞，对于恢复肺泡上皮结构至关重要。然而，IPF 患者会严重丧失 AT1 细胞，AT2 向 AT1 的分化对于肺泡上皮结构的修复不可或缺，但在肺纤维化过程中，这一分化的调控机制却一直未被阐明。
Delta 样非经典 Notch 配体 1（DLK1）作为父系印记基因，在胎儿组织中表达，出生后大多组织中缺失，但在组织修复过程中表达增加。已有研究表明，DLK1 在干细胞分化和癌症干性中发挥重要作用，在肝纤维化中可通过上调肝星状细胞活化加剧纤维化，在心肌纤维化中则通过调节成纤维细胞活化和细胞外基质沉积发挥作用。但在呼吸系统疾病中，其在肺纤维化及 AT2 分化中的作用尚不清楚。因此，探究 DLK1 在肺纤维化中的作用及机制，对于寻找 IPF 的治疗新靶点具有重要意义。
为解决上述问题，同济大学医学院附属东方医院等机构的研究人员开展了相关研究，其成果发表在《Respiratory Research》上。研究发现，抑制 DLK1 可通过调控 AT2 分化，经由 TTF-1/CLDN6 通路缓解已建立的肺纤维化，为 IPF 的治疗提供了新的思路和潜在靶点。
主要关键技术方法
研究使用了以下主要关键技术方法：
- 样本采集：收集 11 例 IPF 患者肺活检标本及 11 例肺癌患者肺实质作为对照样本。
- 动物模型构建：构建博来霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型。
- 病毒载体技术：利用肺泡上皮特异性腺相关病毒（AAV）6 载体系统构建上皮 DLK1 敲低小鼠。
- 细胞分离与培养：从 SPC-EGFP 小鼠分离原代 AT2 细胞，进行 2D 和 3D 类器官培养。
- 流式细胞术（FCM）：分析细胞表面标志物，鉴定 AT2 细胞等。
- 分子生物学技术：包括 Western blotting、实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、RNA 测序等，检测基因和蛋白表达。
- 组织学染色：如 H&E 染色、Masson 染色、天狼星红染色等，评估肺组织病理变化。
研究结果
DLK1 在纤维化肺中表达上调
通过对 IPF 患者肺组织和 BLM 诱导的小鼠纤维化肺组织分析发现，IPF 患者肺中 DLK1 的 mRNA 约为非 IPF 对照的 4 倍，蛋白水平也显著升高，免疫组化显示 DLK1 阳性区域是健康个体的两倍。在小鼠模型中，BLM 处理第 14 天，DLK1 蛋白和 mRNA 水平均高于对照组，免疫荧光显示第 14 天 DLK1 表达最高，证实 DLK1 在人和小鼠纤维化肺中均上调。
DLK1 主要在肺纤维化的 AT2 细胞中表达
利用 SPC-EGFP 小鼠进行流式细胞术分析，发现基线时超过 85% 的 SPC?AT2 细胞显著表达 DLK1。共染色显示，与基线相比，BLM 诱导后第 7 天和第 14 天，DLK1 与 AT2 标记物 pro-SPC 的共表达增加，而在巨噬细胞和成纤维细胞中 DLK1 几乎不存在，表明 DLK1 在肺纤维化中主要在 AT2 细胞中高表达。
AAV6 介导的肺泡上皮 DLK1 敲低减轻 BLM 诱导的纤维化
构建 AAV-siDLK1 病毒载体，经气管内给药至小鼠肺部，发现其显著减轻 BLM 诱导的肺纤维化，减少胶原沉积，Micro-CT 显示肺部纤维化程度降低，纤维化相关基因 α-SMA、波形蛋白、胶原 1 的蛋白和 mRNA 水平均低于对照组。此外，还能减少免疫细胞浸润，降低 CD45?F4/80?巨噬细胞浸润。
敲低 DLK1 减少小鼠纤维化模型中的肺泡损伤
BLM 组 AT2 细胞的比例和数量均低于对照组，而 DLK1 条件性敲低可使其恢复。BALF 中 CD45?细胞和 AT2 细胞数量在 AAV-siDLK1 组低于 NC 组，TUNEL 染色显示 AAV-siDLK1 处理减少总细胞凋亡，WB 显示 Bcl2/BAX 比值更高，表明敲低 DLK1 可减少肺泡损伤。
si-DLK1 促进 AT2 细胞的增殖和分化
体内实验显示，AAV-si-DLK1 增加了肺中 SPC?Ki67?AT2 细胞的比例，AT1 标记物 AQP5 的共表达比例也更高。体外实验中，重组 DLK1 蛋白抑制 AT2 细胞增殖，而 si-DLK1 处理可恢复 PCNA 表达；3D 类器官培养显示 DLK1 抑制 AT2 再生，诱导后 AT2 向 AT1 分化减少，表明 DLK1 抑制 AT2 的增殖和分化。
重组 DLK1 加剧纤维化，而 si-DLK1 在体外缓解纤维化
在 TGF-β 诱导的 A549 和 MRC5 细胞模型中，DLK1 水平升高。添加重组 DLK1 上调促纤维化基因 TGF-β、纤连蛋白，si-DLK1 则抑制胶原 1 等表达，表明 DLK1 在基线和纤维化条件下均具有促纤维化作用。
DLK1 通过抑制 AT2 细胞中的 TTF-1/CLDN6 促进纤维化
RNA 测序发现，AAV-siDLK1 处理的 AT2 细胞中 CLDN6 显著上调，转录因子 TTF-1 表达增加。IPF 肺组织中 DLK1 上调而 TTF-1 下调，免疫荧光显示 DLK1 与 TTF-1 在 SPC?AT2 细胞中空间共定位。机制上，DLK1 抑制 TTF-1，进而调控 CLDN6，同时影响 PTEN/PI3K/AKT 通路，抑制 TGF-β/Smad2/3 信号。
研究结论与讨论
本研究首次揭示 DLK1/TTF-1/CLDN6 轴在肺纤维化中调控 AT2 分化的作用。DLK1 主要在 AT2 细胞中表达，在 IPF 和 BLM 诱导的纤维化中上调。上皮特异性敲低 DLK1 可促进 AT2 的更新和分化，减轻肺纤维化，其机制与上调 TTF-1/CLDN6 和调控 PTEN/PI3K/AKT 通路有关。
该研究为 IPF 的治疗提供了新的潜在靶点 DLK1，表明抑制 DLK1 可能成为逆转已建立纤维化的新策略。然而，DLK1 与 TTF-1 在 AT2 细胞中的空间共定位如何影响 AT2 分化仍需进一步探索，且需要更多临床研究验证 DLK1 抑制在肺纤维化中的益处。未来研究可采用人精密肺切片（PCLS）等模型进一步验证 DLK1 的作用及相关机制，为 IPF 的治疗转化提供更坚实的基础。
