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本文综述 CRISPR 相关（Cas）反式切割活性在非核酸（NNA）检测中的应用，介绍其原理与优势，将检测策略分为游离激活剂生成 / 消耗、crRNA 合成、活性 Cas 效应器重建三类，探讨临床与非临床应用的挑战及策略。
基于 CRISPR 的非核酸检测技术：原理、策略与应用前景
一、CRISPR 诊断新时代：从核酸到非核酸的跨越
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）系统的反式切割活性，开启了新一代诊断技术的大门。传统 CRISPR 技术以核酸检测为核心，而近年来，通过将反式切割反应作为信号输出模块，该系统已被成功改造，用于检测离子、无机小分子、有机化合物、蛋白质及细菌等非核酸（NNA）目标物。这种检测模式不仅拓展了 CRISPR 技术的应用边界，更凭借其高灵敏度、快速响应及无气溶胶污染风险等特性，在临床与非临床场景中展现出巨大潜力。
二、检测原理与核心优势
CRISPR-based NNA 检测的核心逻辑，是将目标 NNA 的存在与否与 CRISPR 系统三大关键组件（激活剂、CRISPR RNA（crRNA）、Cas 效应器）的可及性关联。当目标 NNA 出现时，通过特异性识别策略（如适配体、DNA 酶、变构转录因子（aTFs）、抗体或基于辅因子的生化反应）触发信号传导，进而调控 Cas 蛋白的反式切割活性 —— 或通过生成信号分子激活切割反应，或通过消耗抑制因子解除切割抑制，最终以核酸片段的切割产物作为可视化信号输出。
该技术的显著优势包括：①信号放大能力：反式切割反应可将微量目标信号逐级放大，实现飞摩尔级检测；②多重兼容性：通过设计不同识别元件，可适配从离子到细菌的广泛目标类型；③操作便捷性：无需复杂仪器，适用于现场快速检测；④生物安全性：闭环反应设计降低了传统核酸检测中气溶胶污染的风险。
三、检测策略的分类与机制解析
根据信号调控方式的不同，CRISPR-based NNA 检测策略可分为以下三类：
（一）游离激活剂的生成或消耗
该策略通过目标 NNA 诱导激活剂（如特定核酸序列或小分子）的生成或消耗，间接调控 Cas 蛋白活性。例如，当目标离子（如 Mg2?）存在时，可通过催化 DNAzyme 构象变化释放游离激活剂，激活 Cas12a 的反式切割活性；反之，若目标分子与激活剂结合使其失活，则会抑制切割反应。此类策略依赖于目标物与激活剂之间的动态相互作用，通过信号分子的浓度变化实现检测。
（二）crRNA 的合成调控
crRNA 作为引导 Cas 蛋白识别靶标的关键元件，其合成过程可被目标 NNA 直接调控。例如，在基于适配体的检测系统中，目标蛋白质与适配体结合后，可触发逆转录酶或 RNA 聚合酶介导的 crRNA 合成，生成的 crRNA 与 Cas9 结合形成复合体，进而切割报告序列产生信号。该策略将 NNA 识别与 crRNA 生物合成偶联，实现了从蛋白质到核酸信号的跨分子类型转换。
（三）活性 Cas 效应器的重建
通过目标 NNA 诱导 Cas 蛋白结构域的重组装或构象激活，恢复其反式切割能力。典型案例包括：利用抗体 - 抗原相互作用将 Cas 蛋白的两个功能结构域拉近，形成完整的活性复合体；或通过目标小分子诱导 Cas 蛋白构象变化，暴露催化位点。此类策略模拟了天然 Cas 蛋白的激活机制，通过空间结构调控实现信号传导，具有较高的特异性。
四、应用场景与挑战
在临床领域，CRISPR-based NNA 检测可用于病原体（如细菌）的快速鉴定、肿瘤标志物（如蛋白质抗原）的定量分析及代谢物（如葡萄糖）的实时监测；在非临床场景中，其应用涵盖环境污染物（如重金属离子）检测、食品安全（如农药残留）筛查及工业发酵过程监控等。然而，该技术仍面临以下挑战：
- 多重检测兼容性：复杂生物样本中多种成分可能干扰信号传导，需开发抗干扰能力更强的识别元件；
- 体内应用限制：Cas 蛋白的免疫原性及递送效率制约了其在活体检测中的应用，需优化纳米载体系统；
- 标准化与成本：现有检测体系缺乏统一的性能评价标准，且部分酶试剂成本较高，限制了大规模普及。
五、未来发展方向
为推动 CRISPR-based NNA 检测的实际应用，可从以下方向突破：
- 元件工程化：通过蛋白质定向进化优化 Cas 蛋白的底物特异性与稳定性，开发新型适配体或 DNAzyme 以拓展目标识别范围；
- 多模态整合：结合微流控技术实现样本预处理、检测及结果分析的全流程自动化，提升检测通量；
- 临床转化研究：开展多中心临床验证，建立检测性能与诊断标准的对应关系，推动技术向 IVD（体外诊断）产品转化。
CRISPR-based NNA 检测技术通过跨学科融合，将基因编辑工具转化为精准检测平台，为生命科学研究与疾病诊断提供了全新范式。随着技术迭代与应用场景的不断拓展，该领域有望在精准医疗、公共卫生及环境监测等领域开辟更广阔的发展空间。
