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该研究针对 DNA 损伤响应机制中 PARP1 动态测量难题，利用分段 FCS 技术结合激光共聚焦显微镜，发现 PARP1 在损伤位点 mobility 降低，出现结合组分，且光漂白影响动力学测量。为解析 PARP1 功能及 DNA 修复机制提供新工具与思路。
在生命科学领域，DNA 损伤响应机制一直是研究者关注的核心问题之一。细胞每天都会受到紫外线、化学试剂等因素的威胁，导致 DNA 出现单链或双链断裂等损伤。及时且准确地修复这些损伤对于维持基因组稳定性和细胞正常功能至关重要。PARP1（聚 ADP - 核糖聚合酶 1）作为 DNA 损伤响应中的关键蛋白，通过 PARylation（聚 ADP - 核糖化）过程招募修复复合物至损伤位点，但其在损伤位点的动态行为，如扩散、结合等特性，仍存在许多未解之谜。传统的 FRAP（荧光恢复后光漂白）和 FCS（荧光相关光谱）技术虽能提供部分动力学信息，但在复杂的细胞环境中，如何精准区分损伤与未损伤区域的分子行为，以及光漂白等因素对测量的干扰，一直是制约该领域深入研究的瓶颈。
为了攻克这些难题，意大利卡塔尼亚大学（University of Catania）和意大利技术研究院（Istituto Italiano di Tecnologia）等机构的研究人员开展了相关研究。他们开发并应用分段荧光相关光谱（Segmented FCS）技术，结合商用激光共聚焦显微镜（CLSM），对活细胞中 DNA 损伤位点的 PARP1 动态进行了高时空分辨率的测量。研究成果发表在《Biophysical Journal》上，为揭示 PARP1 在 DNA 损伤响应中的作用机制提供了关键 insights。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，利用 405 nm 激光微照射 Hoechst 敏化的 HeLa 细胞，诱导局部 DNA 损伤；其次，通过表达 PARP1-RFP（标记红色荧光蛋白的 PARP1 抗体）对目标蛋白进行标记；然后，使用 Leica TCS SP8 共聚焦显微镜进行快速线扫描，采集荧光信号；最后，通过 MATLAB 脚本对数据进行时间分段处理，分离损伤与未损伤区域的信号，并计算自相关函数（ACF）以分析分子 mobility。
测量 PARP1-RFP 在 DNA 损伤后的动态变化
通过分析 PARP1-RFP 在损伤位点的强度时间曲线，发现其在损伤后迅速积累，积累时间常数 τACC为 2.1±1.5 s，但长时间强度衰减常数 τDEC受光漂白影响显著。低激光功率（0.3 μW）下 τDEC为 90±28 s，而高功率（14 μW）下缩短至 60±11 s，表明光漂白会加速信号衰减，影响动力学参数的准确性。
分段 FCS 检测 PARP1-RFP 在损伤位点的 Mobility 差异
分段 FCS 分析显示，未损伤区域的 PARP1-RFP 主要表现为扩散行为，扩散系数 DOUT为 3.8±3.1 μm2/s，与既往研究结果一致；而损伤区域的 PARP1-RFP 出现明显的结合组分，结合分数 FB=0.62±0.12，扩散系数降低至 1±1 μm2/s，结合时间 τB=1.6±1.8 s。这表明 PARP1 在损伤位点与 DNA 发生特异性结合，导致 mobility 显著下降。进一步研究发现，结合时间 τB不受激光功率影响，验证了分段 FCS 技术在排除光漂白干扰方面的有效性。
研究结论表明，分段 FCS 技术能够精准区分 DNA 损伤与未损伤区域的 PARP1 动态，证实了 PARP1 在损伤位点从自由扩散向结合状态的转变。这一发现不仅为理解 PARP1 在 DNA 修复中的功能提供了直接的动力学证据，还揭示了光漂白对传统 FCS 测量的干扰机制。该方法基于商用显微镜，具有广泛的适用性，为研究其他 DNA 损伤响应蛋白（如 53BP1、MRE11 等）的动态行为提供了新的技术范式，有助于推动单细胞水平 DNA 修复机制的深入研究，为开发靶向 PARP1 的抗肿瘤药物（如 PARP 抑制剂）提供了关键的理论依据。
